第三章 固定化酶催化反应动力学

化学与生命科学学院第3章固定化酶催化反应动力学生化工程电子教案2023/10/24第3章固定化酶催化应动力学>>概述（一）固定化酶的应用1、食品工业漆酶是一种结合多个铜离子的蛋白质，属于铜蓝氧化酶■啤酒、果蔬汁等贮藏浑浊或沉淀现象？■果汁生产，果胶存在，提产及去浊澄清问题？影响：出汁率低；果汁浊，黏度高，易出现沉淀。■食品工业的绿色生产问题?原因:酚类与蛋白质生成大分子物质固定化果胶酶方法:漆酶淀粉糖/高果糖浆2023/10/24第3章固定化酶催化应动力学>>概述（一）固定化酶的应用2、燃料工业（生物柴油）主要酸碱催化。固定化脂酶2023/10/24第3章固定化酶催化应动力学>>概述（一）固定化酶的应用3、医药工业◆固定化青霉素酰化酶合成头孢羟氨苄（代替青霉素）◆固定化脂肪酶合成VC棕榈酸酯◆固定化酶药物蛋白类口酶口服易分解，固定后有助于保持活性2023/10/24第3章固定化酶催化应动力学>>概述（二）固定化酶与游离酶◆自由酶(FreeEnzyme)酶直接加入至溶液中，酶自身的空间结构不发生改变，保持自己的生物特性◆固定化酶(ImmobilizedEnzyme)通过物理或化学的手段，将酶固载在某种基体上。2023/10/24什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性载体水不溶性酶（固定化酶）固定化技术2023/10/24第3章固定化酶催化应动力学>>概述（三）固定化酶反应器的特点1、自由酶反应器优点：酶解效率高、使用比较方便，特别是在大批量样品处理时。缺点：不能重复使用、寿命短、产物分离难度大2023/10/24第3章固定化酶催化应动力学>>概述2、固定化酶的优点（三）固定化酶反应器的特点◆易于将酶与底物及产物分离，产物相对容易提纯；◆酶能够重复利用，使用效率提高，成本低；◆大多数情况下可以提高酶的稳定性；◆可以增加产物的收率，提高产物质量；◆有利于实现管道化、连续化以及自动化操作，易于与各种分离手段联用。2023/10/24第3章固定化酶催化应动力学>>概述2、固定化酶的缺点（三）固定化酶反应器的特点◆但由于固定化酶是通过反应而被结合在载体上，固定化过程中酶的活力难免有一定损失；◆而底物则要求是水溶性的，这样才能够接触酶而发生反应；◆也不适宜于需要辅助因子的反应。2023/10/24第3章固定化酶催化应动力学>>概述（四）酶的固定化方法CovalentbondCrosslinkageIonicbondInvestmentMicrocapsule2023/10/24第3章固定化酶催化应动力学>>概述１、吸附法(Adsorption)（四）酶的固定化方法◆吸附法有物理吸附、离子吸附及螯合或金属结合法。常用的载体如淀粉、谷蛋白等有机类载体，活性炭、多孔玻璃、硅胶等无机类载体，大孔型的合成树脂，陶瓷以及纤维素衍生物类。阴、阳离子交换剂◆◆pH，影响载体和酶的电荷变化,影响酶吸附；离子强度，一般认为盐阻止吸附；蛋白质浓度，蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和；温度，蛋白质往往是随温度上升而减少吸附；吸附速度，蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多；载体，对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越强。影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素2023/10/24第3章固定化酶催化应动力学>>概述（四）酶的固定化方法２、包埋法(Entrapment)包埋类型可有：网格型、微囊型及脂质体液膜型。包埋法是将游离酶包埋于格子或微胶囊内，格子的结构可以防止酶渗出到周围的培养基中，而底物分子仍能渗入格子内与酶接触。2023/10/24第3章固定化酶催化应动力学>>概述３、共价键合法(Covalentbonds)（四）酶的固定化方法交联法和肽键键合法氨基：赖氨酸的氨基和多肽链的末端氨基；羧基：天冬氨酸的羧基，谷氨酸的羧基和末端羧基；酚基：酪氨酸的酚环；巯基：半胱氨酸、蛋氨酸的巯基；羟基：丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的羟基；咪唑基：组氨酸的咪唑基；吲哚基：色氨酸的吲哚基。2023/10/24第3章固定化酶催化应动力学>>概述SynthesisofIMERusingglutaraldehydemethod1.戊二醛法Ye,M.L.

etal.Electrophoresis,2005,25:1319-1326常用的共价键合方法（四）酶的固定化方法2023/10/24第3章固定化酶催化应动力学>>概述（四）酶的固定化方法SynthesisoftheIMERusingDSCmethod2、二琥珀酰亚胺碳酸酯法(DSC)Rawale,S.,etal.J.Med.Chem.,2002,45:937-43Calleri,E.,etal.,J.Pharm.Biomed.Anal.,2003,32:715-24常用的共价键合方法2023/10/24第3章固定化酶催化应动力学>>概述（四）酶的固定化方法常用的共价键合方法3、β-羟胺形式(β-hydroxylamineformation)ThesynthesisoftheIMERthroughβ-hydroxylamineformationMarleI.,etal.J.Chromatogra.1992,A,604:185-196

2023/10/24第3章固定化酶催化应动力学>>概述（四）酶的固定化方法4、交联法

利用双功能或多功能试剂在酶分子间或酶与载体间，或酶与惰性蛋白间进行交联反应，以制备固定化酶的力法。最常用的交联试剂是戊二醛，其他如苯基二异硫氰、双重氮联苯胺-2，2’二磺酸、1，5—二氟—2，4—二硝苯、己二酰二胺甲脂等。用戊二醛交联制备固定化酶的反应如下：2023/10/242023/10/24第3章固定化酶催化应动力学>>概述被固定的微生物细胞所用载体和方法底物产物或用途酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)硅和聚氧乙稀碎片，吸附葡萄糖乙醇酿酒酵母魔芋葡甘露糖，共价葡萄糖乙醇酿酒酵母海藻酸钙，包埋麦芽汁啤酒委内瑞拉链霉菌(Streptomycesvenezuelae)明胶，微囊葡萄糖果糖固定化酶／细胞的应用实例2023/10/24第3章固定化酶催化应动力学>>概述被固定的微生物细胞所用载体和方法底物产物／用途黑曲霉(Aspergilusniger)甲基丙烯酸缩水甘油脂聚合物戊二醛交联葡萄糖葡萄糖酸芽孢杆菌(Bucillussp.)聚丙烯酰胺，包埋蛋白胨等杆菌肽粘质赛氏菌(Serratiamarcescens)卡拉胶，包埋明胶，蛋白胨等碱性蛋白酶珊瑚诺卡氏菌(Nocardiacorallina)酚醛树脂，吸附丙烯腈废水处理废水荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)明胶，包埋葡萄糖血糖检测传感器固定化酶／细胞的应用实例2023/10/24第3章固定化酶催化应动力学>>概述固定化酶／细胞的应用实例被固定的微生物细胞载体和方法底物产物或用途木醋杆菌(Acetobactesxylinum)卡拉胶，包埋乙醇酒精检测传感器柱孢鱼腥蓝细菌(Anabaenacylindrica)玻璃珠，吸附光解水HO链鱼腥蓝细菌(Anabaenaazollae)海藻酸聚赖氨酸，微囊N2固氮荨麻青霉(Penicilliumurticae)角叉菜聚糖，包埋葡萄糖，酵母提取物棒曲霉素丙酸细菌(Propionibacteriumsp.)光交联树脂，包埋硫酸钴、甘氨酸等B12谷氮酸棒杆菌(Corynebacterium

glutamicum)聚丙烯酰胺，包埋葡萄糖等L-谷氨酸2023/10/24第3章>>第1节固定化催化的动力学特征讨论几个问题：１、糖在水中溶化，不搅拌与搅拌时，异同？２、香味传播？有风无风，异同？３、自由酶、固定酶，反应异同？2023/10/24第3章>>第1节固定化催化的动力学特征一、酶固定化对其动力学特性的影响酶固定后，酶本身的结构必然受到扰动，同时酶固定后，由于扩散限制效应、空间位阻作用以及载体性质等因素必然对酶的性质产生影响。2023/10/24第3章>>第1节固定化催化的动力学特征１、固定化酶的活力一、酶固定化对其动力学特性的影响酶活力表现率一般降低(Km)EnzymeAgentofimmobiliztionsubstrateKm/(mol/L)CreatinekinaseFreeEATP6.5×10-4AminobenzoiccelluloseATP8.0×10-4LactatedehydrogenaseFreeENADH7.8×10-6Propionyl-glassNADH5.5×10-5αchymotrypsinFreeEATEE1.0×10-3Soluble-aldehydeglucoseATEE1.3×10-3FicusproteinaseFreeEBAEE2.0×10-2CMC-70BAEE2.0×10-2TrypaseFreeEBAA6.8×10-3Maleate/ethylideneBAA2.0×10-4Tab1M-constantoffreeEandimmobilizedE2023/10/24第3章>>第1节固定化催化的动力学特征２、固定化酶的稳定性一、酶固定化对其动力学特性的影响热稳定性普遍提高保存期t1/2增1倍;热稳定性比溶液Ｅ提高10倍以上(空间结构坚固，加热不易变型)2023/10/24第3章>>第1节固定化催化的动力学特征二、影响固定化酶动力学的因素1、空间效应（包括构象和屏蔽）酶，三维空间结构；固定化，由于E与载体的相互作用，引起酶活性部位发生扭曲变形，改变活性部三维结构，减弱了结合力，称构象效应。载体的存在使底物分子不易与酶活性部位接触，对酶活性部位造成空间障碍，使酶活下降，称屏蔽效应（位阻效应）2023/10/24第3章>>第1节固定化催化的动力学特征二、影响固定化酶动力学的因素1、空间效应（包括构象和屏蔽）图、固定化酶的结构改变和屏蔽效应2023/10/24第3章>>第1节固定化催化的动力学特征二、影响固定化酶动力学的因素2、分配效应含固定化酶的多种载体示意图几个概念◆构成多相体系；◆微环境（固酶附近）◆主体溶液◆分配效应(S\P浓度不同的现象)2023/10/24第3章>>第1节固定化催化的动力学特征二、影响固定化酶动力学的因素3、扩散效应几个概念◆酶固定→酶浓度不均匀,S均匀→S向活性扩散,反应后P向溶液扩散

；◆内扩散（固酶内表面向微孔内酶活性中心）◆外扩散(溶液主体向固定化酶表面)◆反应和扩散的关系内扩散效应和外扩散效应?2023/10/24第3章>>第2节外扩散限制效应第2节外扩散限制效应固定化酶与液相反应物系相接触的反应过程为:第一步：底物由液相主体扩散到载体的外表面第二步：底物在载体的外表面进行反应第三步：产物由外表面扩散到液相主体传质过程反应过程2023/10/24第3章>>第2节外扩散限制效应再次回顾前面讨论的两个问题：１、糖在水中溶化，不搅拌与搅拌时，异同？２、香味传播？有风无风，异同？回答:溶解和传播速度与什么有关?扩散速率∝?浓度差面积×比例系数是多少?kL2023/10/24第3章>>第2节外扩散限制效应扩散速率=浓度差面积×单位?传质系数kL再次回顾前面讨论的两个问题：×单位液体所具有的传质面积a单位时间单体积所传递的物质量kmol/(L.s)m2/m3=1/mCso-Csimol/L单位?单位?单位?扩散速率=kL

×a×(Cso-Csi)2023/10/24第3章>>第2节外扩散限制效应一、外扩散速率对酶催化反应速率的限制以酶促反应为例，在载体外表面的酶促反应符合M-M方程：式中RS

i——载体外表面的底物消耗速率，（mol/L·s）

CS

i——载体外表面的底物浓度（mol/L）2023/10/24第3章>>第2节外扩散限制效应底物由液相主体扩散到载体表面的扩散速率：一、外扩散速率对酶催化反应速率的限制式中RSd——底物由液相主体扩散到载体表面的扩散速率，（mol/L·s）

kL——液膜的传质系数，（m/s）

a——单位体积的反应物系具有的传质面积，（m2/m3=1/m）

kLa——体积传质系数，kLa=kL

·a，（1/s)CS0——液相主体的底物浓度，（mol/L）2023/10/24第3章>>第2节外扩散限制效应在稳定的状态下有：？？一、外扩散速率对酶催化反应速率的限制反应速度=外扩散速度也就是：当外扩散速率很快时，而反应速度较慢时，此时无外扩散的限制（表面浓度近似等于主体浓度）：

Rso=液相主体反应速度，即游离E反应速度,也是无扩散影响的最大反应速率(本征反应速率).2023/10/24第3章>>第2节外扩散限制效应当外扩散速率很慢时，外扩散为限制步骤，固定化酶外表面上底物浓度趋近于零，此时：一、外扩散速率对酶催化反应速率的限制rd为在外扩散速率很慢时的最大的传质速率。2023/10/24第3章>>第2节外扩散限制效应有效速率Rsi、反应最大速率Rso、扩散最大速率rd与主体浓度Cso之间的关系一、外扩散速率对酶催化反应速率的限制①？曲线②？曲线③？曲线2023/10/24第3章>>第2节外扩散限制效应一、外扩散速率对酶催化反应速率的限制■可分几个区？RsordCsoABC■三个区的特征？2023/10/24第3章>>第2节外扩散限制效应一、外扩散速率对酶催化反应速率的限制由曲线关系：■A部分，外扩散控制Cso较小时，Rso>rd；此时Rsi=rd■C部分，动力学控制Cso较大时，Rso<rd;此时

Rsi=Rso■B部分，反应速率与外扩散速率相差不大，此时宏观反应速率如何求？？RsordCsoABC2023/10/24第3章>>第2节外扩散限制效应反应速率与外扩散速率相差不大，求反应速率的方法：一、外扩散速率对酶催化反应速率的限制1、由Csi确定Rsi令：无因次浓度无因次M-M常数

Damköhier准数（丹克莱尔准数）2023/10/24第3章>>第2节外扩散限制效应代入上式有:反应速率与外扩散速率相差不大，求反应速率的方法：一、外扩散速率对酶催化反应速率的限制1、由Csi确定RsiDa的意义为??◆当Da>>1时?控制◆当Da<<1时传质扩散限制反应速率限制2023/10/24第3章>>第2节外扩散限制效应一、外扩散速率对酶催化反应速率的限制例：某酶固定于无微孔的球形载体上，在排除外扩散影响的条件下测得其动力学参数为rmax=4×10-5mol/(L·s)，Km=2×10-5mol/L，现将固定化酶颗粒装入底物浓度为1×10-5mol/L反应器中，并已知在这一操作条件下流体传质系数为4×10-1(1/S)，求：底物在固定化酶的外表面的反应速率。2023/10/24第3章>>第2节外扩散限制效应解：2023/10/24第3章>>第2节外扩散限制效应所以2023/10/24第3章>>第2节外扩散限制效应反应速率:比较当未固定化的为促反应速率:2023/10/24第3章>>第2节外扩散限制效应反应速率与外扩散速率相差不大，求反应速率的方法：一、外扩散速率对酶催化反应速率的限制2、引入外扩散有效因子hE外扩散的有效因子的定义:2023/10/24第3章>>第2节外扩散限制效应一、外扩散速率对酶催化反应速率的限制反应速率与外扩散速率相差不大，求反应速率的方法：效率因子法求外扩散影响固酶表面反应速率公式————从上式可看出，ηE近似于1，Rsi=rso,说明固酶表面底物浓度与主体的相同，此时反应未受外扩散影响2、引入外扩散有效因子从上式可看出，ηE<<1，Rsi<<rso,说明宏观反应速率已由外扩散控制2023/10/24第3章>>第2节外扩散限制效应一、外扩散速率对酶催化反应速率的限制2、引入外扩散有效因子法求反应速率的方法讨论：（1）外扩散控制Da>>1P40式（3-25）何来？一级动力学特性（2）反应动力控制Da<<12023/10/24第3章>>第2节外扩散限制效应一、外扩散速率对酶催化反应速率的限制2、引入外扩散有效因子法求反应速率的方法有效因子与Da关系曲线Da及β已知时，可求ηP412023/10/24第3章>>第2节外扩散限制效应二、外扩散限制及化学抑制同时存在的动力学1、非竞争性化学抑制2、底物抑制2023/10/24第3章>>第3节内扩散限制效应三、降低外扩散效应的技术措施式中De——扩散系数，取决于传质物质的性质

Δy——传质阻力临界膜厚度1、提高传质系数的措施◆改变反应液相的流动状态；降低Δy：？

◆适当的搅拌2023/10/24第3章>>第2节外扩散限制效应2、提高传质速率适当提高液相主体的底物浓度CS0可提高传质速率RSd，降低外扩散的限制。三、降低外扩散效应的技术措施2023/10/24第3章>>第3节内扩散限制效应Whatisinner-diffusioneffect?——introductionAdsorptionbyporousmediumImmobilizedenzymeinvestHowmanymethodscanbeusedtoprepareIE??Wherewillthebio-reactionproceedforthistwoimmobilizedenzymes?ReactionwithintheIE(usuallycalledgranular)2023/10/24第3章>>第3节内扩散限制效应Whenreactionproceedwithinthegranular,thereactionratewillbeinfluencedbymasstransferprocess,whichincludingtworeciprocaldirections,substratemusttransferfromliquidphasetotheactivitysiteofwithintheimmobilizedenzyme,correspondinglytheproductmusttransferfromIEtoliquidphase.ThemasstransferprocessproceedwithintheIEgranular,soiscalledinnerdiffusioneffect.F(innerdiffusion,ieresistance)=(structureparametersofimmobilizedenzyme,

featureofreactionsystem)Whatisinner-diffusioneffect?2023/10/24第3章>>第3节内扩散限制效应一、载体的结构参数与微孔内的扩散1、载体结构参数（1）、比表面积Sg单位质量载体所具有的内表面积，比表面积Sgm2/g(200-300)（2）、微孔半径ř单位质量载体所具有的孔体积，Vgm3/g2023/10/24第3章>>第3节内扩散限制效应(3)空隙率εP

:whichisratioofmicroporocityvolumetoparticlevolume.

εP

<1一、载体的结构参数与微孔内的扩散1、载体结构参数εP=Vg.ρPρP——表观密度(4)当量直径V=VP45体积相当直径？外表面积相当直径？比表面积直径？2023/10/24第3章>>第3节内扩散限制效应一、载体的结构参数与微孔内的扩散1、载体结构参数(5)

ParticledensityApparentdensityρP=Realdensityρt=Solidsmass/particlevolumeSolidsmass/solidsvolumePackingdensityρb=Solidsmass/bedvolumeBeddensity2023/10/24第3章>>第3节内扩散限制效应一、载体的结构参数与微孔内的扩散2、微孔内扩散分子扩散diffusionresistanceresultfrommolecularcollision,independenttomicropousdiameter.努森扩散diffusionresistanceresultfromcollisionbetweenmolecularandwallofhole,independenttomolecularcollision2023/10/24第3章>>第3节内扩散限制效应一、载体的结构参数与微孔内的扩散2、微孔内扩散分子扩散λ/2r≤1ⅹ10-2努森扩散λ/2r≥10

λ：分子运动平均自由程r：微孔直径λ/2r≤1ⅹ10-2

λ/2r≥10?2023/10/24第3章>>第3节内扩散限制效应二、微孔内反应组分的浓度分布酶反应速度与底物浓度是密切相关的载体内的底物浓度存在着分布不均的问题沿着传质的方向有底物、产物的浓度的分布反应速率因底物浓度的分布而在变化由于底物在载体内的扩散作用以及酶的反应反应速率/浓度均变化，如何求？质量衡算2023/10/24第3章>>第3节内扩散限制效应二、微孔内反应组分的浓度分布推导质量衡算方程的假设条件：◆载体为多孔的球体或其他几何形体。◆酶在载体内是均布的。◆载体几何尺寸上的温度梯度不足以影响酶促反应的速率。◆固定化酶的催化活力不变。

◆仅以扩散的形式进行传质，在载体内没有反应液相的对流。

◆底物、产物的浓度在扩散的方向上变化。P48图3-162023/10/24第3章>>第3节内扩散限制效应扩散模型以Fick定律表述，且扩散系数De在载体内的任意位置均为常数。二、微孔内反应组分的浓度分布推导质量衡算方程的假设条件：◆式中Ns——s组分的扩散通量

De——扩散系数

Cs——s组分的浓度

r——扩散距离2023/10/24第3章>>第3节内扩散限制效应二、微孔内反应组分的浓度分布1、质量衡算方程在某一微体积元dV中的反应对任意组分的质量平衡关系为：对底物有：2023/10/24第3章>>第3节内扩散限制效应R

⊿r

r在球形载体中，取一个直径为r，厚度为Δr的壳层为反应体系，二、微孔内反应组分的浓度分布1、质量衡算方程底物在载体内的扩散和反应处于稳定状态，此时微体积元内的底物累积质量为0。在微体积元内的底物质量平衡为：2023/10/24第3章>>第3节内扩散限制效应二、微孔内反应组分的浓度分布1、质量衡算方程当时，有略去（dr）2项，整理得2023/10/24第3章>>第3节内扩散限制效应二、微孔内反应组分的浓度分布1、质量衡算方程方程（1）的解与rs的形式有关（1）.A.BCO(2-17)2023/10/24第3章>>第3节内扩散限制效应二、微孔内反应组分的浓度分布2、一级动力学浓度分布rs=k1Cs令无因次半径无因次浓度无因次反应级数参比量类M-M反应Thiele模数2023/10/24第3章>>第3节内扩散限制效应二、微孔内反应组分的浓度分布2、一级动力学浓度分布边界条件:令:(2)式(2)变成:2023/10/24第3章>>第3节内扩散限制效应二、微孔内反应组分的浓度分布2、一