超声提取蜘蛛香中总黄酮的工艺优化

超声提取蜘蛛香中总黄酮的工艺优化

蜘蛛虱子。其根茎及根入药,具有理气和中、散寒除湿、活血消肿等功效,用于治疗脘腹胀痛、呕吐泄泻、小儿疳积、风寒湿痹、脚气水肿、月经不调、跌打损伤、疮疖等症。研究发现,其化学成分主要含挥发油、环烯醚萜类、黄酮类等多种成分。近年来药理学研究表明,蜘蛛香中黄酮类化合物具有镇静和催眠作用。而有关蜘蛛香中总黄酮提取方法的研究未见文献报道。为更有效地开发和利用药材资源,充分提取蜘蛛香中所含的总黄酮成分,笔者采用正交设计的方法进行了提取工艺的研究,以期为进一步的开发利用提供参考。1材料和方法1.1仪器、药品和试剂TU-1800紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);KQ2200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)。蜘蛛香于2007年7月采自安徽亳州,经江苏畜牧兽医职业技术学院动物药学系中药教研室鉴定;橙皮苷对照品(中国药品生物制品检定所);其余试剂均为分析纯。1.2方法1.2.1橙皮苷标准溶液配制准确称取橙皮苷标准品0.0051g,加甲醇溶解并定容至50ml,即得浓度为0.102g/L的橙皮苷标准溶液。分别移取上述标准溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml于5只10ml容量瓶中,加甲醇定容,以甲醇作空白,于284nm处测吸光度。以吸光度A对橙皮苷标准溶液浓度C作图,绘制标准工作曲线。1.2.2样品溶液的制备将蜘蛛香药材粉碎并过筛(40～180目),用1∶10的石油醚回流脱脂2次,抽滤,洗涤,再放入40℃条件下的鼓风干燥箱中干燥1h左右,备用。称取1.0g已脱脂的蜘蛛香粉末,加入一定量的溶剂,密塞,摇匀,称定质量,超声提取,取出放冷,再称定质量,用溶剂补足减失的质量,摇匀,离心分离,取上清液(溶剂量的1/5)于旋转蒸发器上浓缩至干,加30ml甲醇溶解,滤去不溶物,滤液加甲醇定容至50ml,即得样品溶液。移取1ml样品溶液,加甲醇定容至10ml,以甲醇作空白,于284nm处测吸光度。并根据线性回归方程计算蜘蛛香总黄酮得率。1.2.3影响提取效果的因素选取乙醇浓度、浸泡时间、固液比和超声时间4个可能影响提取效果的因素做单因素试验。以总黄酮得率为考察指标,确定各因素的合适范围。在考察某一因素对蜘蛛香总黄酮得率的影响时,固定其他因素及水平。1.2.4提取柠蛛香总黄酮的最佳工艺条件的确定在单因素试验的基础上,确定乙醇浓度、固液比和超声时间3个因素进行正交试验(表1),以总黄酮得率为考察指标,确定提取蜘蛛香总黄酮的最佳工艺条件。1.2.5提取工艺的验证为进一步考察最佳工艺的稳定性和合理性,按优化的最佳工艺条件进行重复性试验3次,分别测定蜘蛛香总黄酮的含量。2结果与分析2.1标准工作曲线图1表明,橙皮苷标准品在5.1～25.5mg/L浓度范围内,吸收度与浓度呈良好线性关系。2.2单因素试验2.2.1浸泡时间和浸泡时间对提取效果的影响从图2可看出,随着浸泡时间的延长,总黄酮得率逐渐升高,但超过24h后,对提取效果的影响不大,为了防止其他成分浸出而产生许多杂质成分,浸泡时间最好为24h。2.2.2乙醇浓度对总黄酮得率的影响从图3可以看出,随着乙醇浓度的升高,总黄酮得率急剧升高,在乙醇浓度达到60%时,总黄酮得率达到最大值,之后随着乙醇浓度的增加,总黄酮得率又逐渐变低,主要原因是乙醇浓度不同,极性也不同,60%的乙醇极性与黄酮类物质的极性相似,随着乙醇浓度的升高,一些脂溶性物质的溶出增加,影响了黄酮类物质的浸出。2.2.3溶剂用量的影响一般来说,溶剂用量越大对黄酮类物质的溶解能力越强,越有利于黄酮类物质的扩散,提取效果越好。但是溶剂用量过大将给后续的浓缩等操作带来不便,同时由于已经浸出的黄酮对未浸出的黄酮有协同浸提作用,溶剂用量过大不利于协同浸提。图5表明,当固液比为1∶25时总黄酮得率达到最大值,因此,固液比选取1∶25左右为宜。2.2.4in所需分配的in从图5可以看出,随着超声时间的延长,总黄酮得率先上升后下降,在30min时达到最大值。原因是时间过短,黄酮类物质还未充分溶出,时间在30min时,黄?酮?类?物?质?溶出已达到平衡,再延长超声时间,一些热敏性组分被破坏或超声时间过长溶剂挥发导致乙醇浓度降低而使总黄酮得率下降。2.3时间及固液比对总黄酮提取的影响正交试验和方差分析及显著性检验结果表明,乙醇浓度对蜘蛛香总黄酮的提取效果有显著影响。超声时间对总黄酮提取的影响较小,固液比对蜘蛛香总黄酮的提取效果几乎无影响。由表2可知,3个因素对总黄酮得率的影响大小依次为:乙醇浓度A>固液比C>超声时间B,提取蜘蛛香总黄酮的最佳工艺条件为A2B1C2即浸泡24h,浓度60%乙醇,固液比1∶20,超声时间30min。2.4提取工艺的验证试验由表3可知,测定的结果均等于或优于正交试验表中的任何一组,重现性好,说明该工艺稳定可行。3最佳工艺条件的确定(1)超声提取是一种提取效率较高的提取技术,具有能耗低、效率高、不破坏有效成分的特点。笔者利用超声法提取蜘蛛香总黄酮,通过单因素和正交试验得到的最佳工艺条件为:浸泡24h,浓度60%乙醇,固液比1