粮食真菌检验中的无菌控制

粮食真菌检验中的无菌控制

食物是微生物自然营养的集合。谷物不仅存在于粮食表面，也存在于粮食内部。随着粮食由田间转入仓库,微生物优势菌种类也由田间真菌———交链孢霉等慢慢转变为腐生真菌———曲霉和青霉等。真菌对粮食的品质及其储藏稳定性有很大的影响,极易产生代谢产物———黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素、杂色曲霉毒素等真菌毒素。为了确保测定结果中的真菌来源于粮食本身,真实反映粮食贮藏过程中的微生物种类和数量,在检验操作过程中应对各个环节进行必要的无菌控制,采用安全有效的消毒灭菌技术。粮食中常见的真菌有:交链孢霉、根霉、毛霉、白曲霉、镰刀菌、黄曲霉、棕曲霉、灰绿曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉、黑曲霉等。而江南温润潮湿的气候条件同样适合青霉、毛霉和曲霉的生长。随着尘土从空气中落到微生物实验室的各个地方,极易发生青霉、毛霉等交叉污染。因真菌类微生物菌落较大,一旦形成优势,可以覆盖整个培养皿。因此,灭菌技术成为控制检验结果准确的关键,且贯穿于整个检验过程,不论哪个环节造成污染都会影响测定结果准确性。在GB4789.1—2010《食品微生物学检验总则》、GB4789.2—2010《食品微生物学检验菌落总数测定》、GB4789.15—2010《霉菌和酵母计数》国家标准中,对环境、设备、器械、实验材料等的消毒灭菌均未做出详细说明。因此,根据实际操作过程中的经验,选择采用适当的消毒灭菌技术就很有必要。1粮食微生物的培养基粮食微生物生长的基质是谷物,谷物的含水量较低,一般在11%~15%,长期适应在这类基质上生长繁殖的微生物,也就适应了较高渗透压的环境,致使一些主要粮食微生物在普通培养基上不能生长或生长不良。因此,选择适合粮食微生物生长的培养基是很重要的。在粮食真菌检验中我们所采用的培养基是渗透压较高的,能分离得到较多粮食微生物的改良察氏(Czapek-Dox)培养基,即在察氏培养基的基础上添加60gNaCl。具体配方为:蔗糖30g,NaNO32g,K2HPO41g,MgSO4·H2O0.5g,KCl0.5g,FeSO4·7H2O0.01g,琼脂20g,蒸馏水1000ml。2消毒和消毒为保证在粮食真菌检验过程中处于无菌状态,对各类器具与空间的消毒和灭菌可采用不同的方法。2.1培养基的密封高压蒸汽灭菌法是将待灭菌的物品放进一个密闭的加压灭菌锅内,通过加热,使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸气将锅内的冷空气从排气阀中驱尽后,关闭排气阀,继续加热。此时由于蒸汽不再溢出,可使灭菌锅内的压力增大,沸点增高,温度达100℃以上,从而导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。培养基、无菌水、称量纸的灭菌可采用高压蒸汽灭菌法。将配好的培养基分装在500ml三角瓶中,塞好棉塞(用普通棉花外面包纱布用线扎紧);分装好无菌水(三角瓶225ml和试管9ml);称量纸外面用油纸包好扎紧,然后进行高压蒸汽灭菌。此时,灭菌锅内冷空气排除是否完全极为重要。因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压,当水蒸气中含有空气时,在同一压力下,含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。高压灭菌锅留有不同分量空气时,灭菌效果不同。采用在0.10和0.14MPa压力下,灭菌30min,对500ml三角瓶中培养基高压灭菌锅留有不同分量空气(压力升至0.05MPa时,放气阀排出空气)时的灭菌效果进行比较,在28~30℃恒温箱培养5d后观察,培养基污染情况见表1。从表1可以看出,放气阀排出全部空气,高压灭菌锅压力升至0.10和0.14MPa,灭菌30min时,培养基均没有发生污染情况。因压力表量程最高为0.14MPa,为安全起见,高压灭菌采用0.10MPa,121.5℃,30min,可达到彻底灭菌的效果。2.2紫外线照射与化学药剂的使用效果无菌室、超净工作台、地面、培养箱一般采用波长为200~300nm的紫外线进行杀菌消毒。由于辐射能使空气中的氧电离成[O],再使氧气生成臭氧。紫外线穿透力不大,照射距离为1.2m,为了加强紫外线消毒效果,减少紫外线对人体的伤害,同时又能达到灭菌效果,在实验中采用物理和化学相结合的方法进行灭菌。采用单一的紫外线照射与化学试剂结合使用作比对,将3个打开的平板培养基分别放置在超净工作台、桌面和地面15min后,放入28~30℃培养箱培养5d后观察,结果见表2。由表2可以看出,采用2%~3%来苏儿(煤酚皂液)和紫外线照射相结合的消毒方法效果良好,可以增强紫外线灭菌效果,照射时间可从30min减少到15min,减少了臭氧对人体的危害。因此,在打开紫外灯前,先将无菌室内的桌面、凳子用2%~3%的来苏儿擦拭,然后再开紫外灯照射,达到灭菌目的。同时间隔一周时间在无菌室内喷洒3%~5%石炭酸溶液,以使空气中附着微生物的尘埃落下并杀死一部分细菌,增强灭菌效果。培养箱同等操作。在无菌室紫外消毒时将工作衣、帽进行消毒,双手用75%酒精消毒,避免因人为因素造成的污染。2.3实验方法不同高温能使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关。在菌体受热时,当环境和细胞内含水量越大,则蛋白质凝固就越快,反之含水量越少,凝固越缓慢。因此,与湿热灭菌相比,高温干热灭菌所需温度要高,时间要长。将培养皿(10个一卷)、吸量管(1、10ml,距管口3cm处塞1.5cm左右棉花,松紧适度)、试管分别用报纸包好,放入电烘箱中160℃灭菌2h,温度不能超过180℃,否则报纸会被烤焦,引起燃烧。当温度下降到70℃以下再将物体取出。将培养基倒在160℃高温灭菌2h后的培养皿上,经28~30℃培养5d后观察,结果为阴性。2.4日常检测结果各类器具与空间按照上述不同的方法进行消毒灭菌,在每次检测样品时做2个空白培养皿进行效果评价,通过多次日常检测观察,结果见表3。由表3可知,用以上灭菌技术控制检验过程,可以达到良好的无菌效果。3火焰旁进行在缓冲室内,用灭菌称量纸迅速称取25g粮食样品到装有225ml无菌水中,振荡30min,在超净工作台上进行无菌操作。注意身体不要靠着超净工作台,整个过程都在火焰旁进行。先将培养皿和试管进行编号,吸取样液10ml至试管中,另用1ml吸管反复吹吸混匀;取稀释倍数10-1、10-2、10-3各1ml,分别接入相应标号的培养皿中,每个稀释度接2个培养皿,待琼脂冷却到45℃时(用手背试感到不烫手)倒入约15~20ml左右,马上摇匀冷却,倒置,于28~30℃培养箱中培养5~7d,观察。4真菌形态鉴定选择菌落数在10~150个之间稀释度培养皿的背面划十字,按区域分别计数后相加,根据稀释倍数计算菌落总数,以获得活菌的信息和污染程度。根据菌落形态、大小、色泽、边缘、菌丝和子囊壳等特征,判断真菌的属性,如果不能确定,取出载玻片在酒精灯上消毒,滴加一滴乳酸苯酚固定液,接种针在酒精灯上消毒,然后在无菌的培养基中冷却一下,蘸取一点菌体涂在固定液上,盖上盖玻片,防止气泡,置于低倍镜和高倍镜下观察曲霉、青霉、毛霉、根霉等霉菌的形态特征,重点观察菌丝是否分隔,曲霉和青霉的分生孢子形成特点,对根霉和毛霉的孢子囊和孢囊孢子进行鉴定,绘图。检验用过的平板也要经高压灭菌后再行处理,防止交叉感染。5培养基的使用(1)选择正确的灭菌消毒方法及规范的操作是粮食真菌检验的关键,按上述控制方法进行操作可以达到良好的无菌效果。(2)高温干热灭菌时,电烘箱内物品不要摆得太挤,以免妨碍空气流通,灭菌物品不要接触电烘箱内壁的铁板,灭菌温度不能超过180℃,以防包装纸烤焦起火。在保持160℃,2h恒温时,严防恒温调节自动控制失灵而造成安全事故。待温度下降到70℃后再取出物品。如出现冒烟现象,切忌打开烘箱门,避免燃烧。(3)培养基三角瓶分装,