中药不同分期对实验性sd大鼠骨折愈合过程中fgf-2表达的影响

中药不同分期对实验性sd大鼠骨折愈合过程中fgf-2表达的影响

骨折三级治疗是中医治疗骨折的指导原则。然而，该治疗规则的提出是基于临床经验的积累和总结，对其功能和机制缺乏系统的研究。目前对其作用存在严重分歧,甚至有学者认为没有分期治疗的必要,出现三期治疗、二期治疗及一期治疗的混乱局面,目前临床用药及所开发治疗骨折的中成药几乎均是属于一期治疗的范畴。如何阐明骨折三期治疗对骨折愈合的作用及其机制、明确中医药治疗骨折的合理分期方法是中医骨伤科学亟待解决的课题。本课题组对中药不同分期治疗对SD大鼠骨折愈合的作用进行了X线和组织学初步研究,结果发现分期治疗组骨痂出现时间、骨痂质量和骨折临床愈合时间等方面均优于非分期治疗组(一期治疗组),其中二期治疗有优于三期治疗的趋势。同时,对不同分期治疗对SD大鼠骨折愈合过程中骨生长因子BMPs表达的影响进行了研究,显示三期治疗对BMPs表达的促进作用明显强于一期治疗,而二期治疗又显著强于三期治疗,提示在促进SD大鼠骨折愈合过程中BMPs表达的作用方面,中药分期治疗骨折是必要的,二期治疗可能是中药治疗骨折的最佳分期方法。局部骨生长因子调控着骨折愈合的整个过程,决定着骨折修复的速度与质量。其中,成纤维细胞生长因子-2(fibroblastgrowthfactor-2,FGF-2)为骨折局部重要的关键骨生长因子之一,对促进骨形成细胞的分裂增殖及骨折部位血液循环的重建具有极其重要的作用。本课题组研究了三期治疗对骨折愈合过程中FGF-2及血管内皮生长因子表达的影响,显示三期治疗对FGF-2及血管内皮生长因子表达的促进作用明显强于一期治疗,提示中药治疗骨折实行分期辨证治疗是必要的。但是,不同分期治疗对骨折愈合过程中FGF-2表达影响方面的研究尚未见报道。在此基础上,本实验对不同分期治疗对SD大鼠骨折愈合过程中局部FGF-2表达的影响进行了研究,以进一步探讨中药治疗骨折的合理分期方法。材料和方法1.动物实验室国外动物实验室SD大鼠:北京市实验动物中心提供,SPF级,雄性,健康,体质量(270±20)g。动物实验室:中国中医研究院动物室,二级。实验用中药:同仁堂医药公司崇文门分公司提供。2.poligir成像彩色图像分析仪:Mis-2000SP,MicroimageAnalysisSystem,USA3Y-internationalCo.LTD.连接装有PolaroidMDCNikon的显微镜。图像分析软件:Pixelpro,Ver.4.0.。SP免疫组化染色试剂盒:北京中山生物技术有限公司提供,SP9001,批号:30577916。FGF-2兔抗鼠多克隆抗体:SantaCruzBiotechnology,Inc,北京中山生物技术有限公司提供,批号:D0203。3.平均分组及分组将222只SD大鼠应用随机数字表随机取6只作为正常组,其余造模后平均分为一期、二期、三期治疗组与模型组,每组再随机平均分为9个小组,分别作为骨折后第1、3、5、7、9、12、15、21、28d组,每小组6只。动物分笼喂养,标准饲料。5.配方之间的责任主体本研究所用基本方剂是高等中医药院校统编教材《中医正骨学》中的肢伤一方、二方及三方,各经加减而成:加减肢伤一方:当归12g,赤芍12g,桃仁10g,红花6g,黄柏10g,防风10g,乳香5g,生地黄12g,生甘草6g;加减肢伤二方:当归12g,赤芍12g,续断12g,威灵仙12g,生薏苡仁30g,桑寄生30g,骨碎补12g,五加皮12g;加减肢伤三方:当归12g,赤芍12g,续断12g,威灵仙12g,骨碎补12g,川木瓜12g,生黄芪15g,熟地黄15g,煅自然铜(先煎)10g,土鳖10g。按传统中药水煎剂制备方法制成含生药1.5g/mL的浓缩液。5.3给药方法最佳用药剂量为2倍等效剂量,根据动物体质量和体表面积确定给药量,灌胃,早晚各1次。所有实验动物均于造模后12h给药。5.4骨折期根据骨折愈合分期方法与SD大鼠骨折局部组织学变化,将SD大鼠骨折愈合过程分为3期:早期、中期和后期。5.5后期的骨折工艺根据“中医骨折三期治疗”原则,分3期治疗:早期:活血化瘀、行气止痛,选用加减肢伤一方;中期:接骨续筋、舒筋活络,选用加减肢伤二方;后期:补益肝肾、强筋壮骨,选用加减肢伤三方。将骨折分为早期与后期,即将骨折的原始骨痂形成期和改造塑形期合并作为后期。早期:活血化瘀、行气止痛,选用加减肢伤一方;后期:接骨续筋、舒筋活络、补肝益肾、强筋壮骨,选用加减肢伤二方与三方的综合方:当归12g,赤芍12g,续断12g,骨碎补12g,煅自然铜(先煎)10g,生黄芪15g,熟地黄15g,炙甘草6g。将骨折的早期、中期与后期合并为一期,活血化瘀、行气止痛、接骨续筋、补益肝肾、强筋壮骨,选用加减肢伤一方、二方与三方的综合方:红花10g,当归12g,赤芍12g,续断12g,骨碎补12g,煅自然铜(先煎)10g,生黄芪15g,熟地黄15g,炙甘草6g。给予和实验组等体积的生理盐水。6.大鼠骨髓内固定分别于造模后第1、3、5、7、9、12、15、21、28d,以断髓法每组各处死1小组大鼠,取出胫骨,标本常规处理。纵行切片,厚6µm。常规进行组织学和免疫组织化学检查。7.fgf-2免疫组织化学试验7.1fgf-2兔抗鼠多克隆抗体(1)采用SP法进行免疫组化染色;(2)FGF-2兔抗鼠多克隆抗体,工作浓度为1:30;(3)同时用1组织标本切片,以PBS代替一抗,作为阴性对照。7.2平均光密度选取细胞浆被染成棕黄色为FGF-2表达阳性,未显棕色者为阴性。根据平均光密度MOD值分级:微阳性(MOD≤0.10)、弱阳性(0.10<MOD≤0.20)、中度阳性(0.20<MOD≤0.30)、强阳性(0.30<MOD)。8.图像分析8.1图像选择位置的确定于骨折间隙内,分别于两骨折断端平齐原骨皮质的内、外缘各取1个视野,然后于骨折间隙的中心向两侧骨折断端方向各取1视野,共6个视野。8.2曝光时间、敏感度显微镜的物镜固定为×40,光栅孔径为0.25,光源电压为9mV,曝光时间为0.16s,色温为5500K,敏感度为M,分辨率为1600×1200。8.3fgf-2表达特点采用3Y图像分析仪进行图像分析,FGF-2表达阳性细胞记数与相应MOD测定。阳性细胞的确定条件:(1)染色成棕黄色;(2)细胞核比较清晰;(3)形状比较规则;(4)轮廓比较清楚。完全具备上述条件方确定为阳性表达细胞。图像周边压线的细胞不计数。细胞面积的范围:100-1e+009;FGF-2表达MOD值的范围:-1e+009-1e+009。以每个切片6个视野的阳性细胞数之平均数为该切片的阳性细胞数,6个视野的总MOD之平均数为该切片阳性细胞MOD值。9.kruskal-培养了或f检验方法进行检验FGF-2表达阳性细胞数与MOD值数据以表示,以Kruskal-Wallis检验或F检验方法进行检验,设定α=0.05。P≤0.05,差异具有统计学意义;0.05<P≤0.09,存在有差异的趋势。fgf-2表达情况正常组个别骨细胞FGF-2表达弱阳性,MOD值0.59OD,阳性细胞数3.00个/视野。在骨折愈合过程中不同时段,FGF-2表达定位也随之发生相应改变。骨折后1-5d缺损区内血肿细胞和炎性细胞FGF-2表达阳性,以后间充质细胞、成骨细胞与新形成的骨细胞表达强阳性,随着时间的推移,编织骨逐渐向板层骨转变,骨细胞FGF-2表达的程度显著减弱,阳性细胞数也相应显著减少,当编织骨转化成板层骨时只有散在骨细胞弱阳性。骨折后各组各时间点FGF-2表达阳性细胞光密度值见表1。每组以各时间点FGF-2表达阳性细胞数或MOD的总体平均值为FGF-2表达基础水平,阳性细胞数或MOD值高于此基础水平的各时间点组成FGF-2表达高峰期,该期内最高阳性细胞数或MOD值称为峰值水平。二期治疗组显著高于三期期治疗组(P<0.05);三期治疗组有高于一期治疗组的趋势;一期治疗组明显高于模型对照组(P<0.05)。(1)高峰期出现时间:一期、二期和三期治疗组FGF-2表达高峰期出现时间显著早于模型对照组:二期治疗组比一期治疗组提前4d,一期治疗组比三期治疗组提前2d,三期治疗组比模型对照组提前2d;(2)高峰期持续时间:一期和二期治疗组显著长于三期治疗组和模型对照组,其它各组之间无明显差别。(1)峰值出现时间:二期治疗组明显早于其它组,较其它组提前8d以上,而其它各组间无明显差别。(2)峰值水平:二期治疗组显著高于其他组(P<0.05);有三期治疗组高于一期治疗组、一期治疗组高于模型对照组的趋势。骨折后各组各时间点FGF-2表达阳性细胞计数见表2,其变化趋势与MOD值的变化趋势基本一致。充分利用分期治疗新方法,显著提高骨折愈合过程中fgf-2表达的表达研究发现骨折局部存在大量生长因子,并阐明和克隆了其相应控制基因,如BMP、TGF-ß、FGF-1、FGF-2、PDGF、SGF、IGF-1、EGF、VEGF、IL-1、IL-3、IL-6、TNF、G-CSF、GM-CSF等。其中,FGF-2是广泛存在于机体组织的一种多聚肽,为广谱有丝分裂原,能促进来源于中胚层和神经外胚层细胞的分裂增殖,具有趋化和迁移作用,同时也促进毛细血管内皮细胞的分裂增殖,是一种毛细血管增殖刺激剂,因而对促进骨形成细胞的聚集和增殖及骨折部位血液循环的重建具有极其重要的促进作用。将外源性FGF-2应用于骨折或骨缺损部位,以探索其对骨修复的作用,取得了另人鼓舞的结果。本课题组在发现三期治疗对FGF-2表达的促进作用明显强于一期治疗,显示了在中药治疗骨折实行分期治疗必要性的基础上,对分期对SD大鼠骨折愈合过程中FGF-2表达的影响进行了比较,进一步研究不同分期治疗方法对SD大鼠骨折愈合的作用,以探讨中药治疗骨折的合理分期方法。结果显示:(1)在整个骨折愈合过程中FGF-2表达MOD值和阳性细胞数的总体平均值方面,二期治疗组显著高于三期期治疗组,三期治疗组有高于一期治疗组的趋势,一期治疗组明显高于模型对照组,此说明二期治疗较其它方法能够更显著地提高骨折愈合过程中FGF-2的表达量;(2)在FGF-2表达的高峰期方面:(1)高峰期出现时间:一期、二期和三期治疗组FGF-2表达高峰期出现时间显著早于模型对照组:二期治疗组比一期治疗组提前4d,提前了80%;一期治疗组比三期治疗组提前2d,提前了29%;三期治疗组比模型对照组提前2d,提前了22%。(2)高峰期持续时间:一期和二期治疗组显著长于三期治疗组和模型对照组。此提示二期治疗可以更明显地加速FGF-2的表达、延长其表达高峰的持续时间;(3)在FGF-2表达峰值水平方面:(1)峰值出现时间:二期治疗组明显早于其它组,较其它组提前8d以上,提前了67%以上,而其它组无明显差别。(2)峰值水平:二期治疗组显著高于其他组,有三期治疗组高于一期治疗组、一期治疗组高于模型对照组的趋势。此显示二期治疗不但可以加快FGF-2表达峰值的出现,而且显著地提升了其峰值的水平。骨折愈合的实质是骨细胞再生、骨折完全性修复,其整个过程受局部骨生长因子的调控。局部骨生长因子调控着骨折的整个修复过程,决定着骨折修复的速度与质量。FGF-2是关键的骨生长因子之一,在骨形成细胞聚集、增殖和局部血液循环重建中发挥着极其重要的作用。本研究显示和其它治疗方法相比,二期治疗不但可以明显提高SD大鼠骨折愈合过程中FGF-2的表达量,而且显著加速了FGF-2表达高峰期的出现、延长其高峰期的持续时间,尤其重要的是显著加快了FGF-2表达峰值的出现、提升了峰值的水平,提示二期治疗对骨折愈合过程中FGF-2表达的促进作用显著强于三期治疗和一期治疗,从而说明二期治疗对骨折愈合的促进作用强于三期治疗和一期治疗。所以就促进SD大鼠骨折愈合过程中FGF-2表达的作用方面而言,二期治疗可能是中药治疗骨折的最佳分期方法。4.小组在SD大鼠双侧胫骨上1/3段前的中点造成2mm×1.5mm的骨质缺损,复制骨折模型。5.1基本配方的组成5.2给药