第三章 植物外源DNA的导入

第三章

植物外源DNA的导入方法

外源DNA的导入是指通过某种特定的途径将外源基因或外源DNA片段导入受体细胞，使之整合到受体细胞基因组中，而实现其功能表达的过程。

目前已经建立了十多种外源DNA导入方法，按照技术属性可将它们分为物理法、化学法、生物法：1、物理法：基因枪法、电激法、微注射法、激光穿刺法、超声波法、碳化硅纤维法等；2、化学法：聚乙二醇（PEG）法、磷酸钙－DNA共沉淀、脂质体法等；3、生物法：农杆菌介导法、花粉管通道法、浸渍法、病毒介导法等。

按照媒介类型的有或无，可分为载体介导法、直接导入法和种质系统介导法：1、载体介导法：将目DNA转入农杆菌或病毒中，并以之为载体，随着它们对植物的感染而将目的DNA导入植物细胞中；2、直接导入法：以裸露的外源DNA通过化学或物理方法直接导入植物细胞；3、种质系统介导法：借助植物自身的种质细胞与媒介（如花粉、子房、花粉管通道、幼胚等）来实现外源DNA导入，它包括花粉管导入法、子房、幼穗、幼胚注射法、种子浸渍法等。第一节

农杆菌介导法一、原理农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，它们侵染植物后能诱发植物形成肿瘤。从一种致癌的农杆菌中分离出了一种巨大质粒（约200Kb），称为致癌质粒，简称Ti质粒。Ti质粒上有一段DNA被称为转移DNA（简称T－DNA），能转移并整合到植物染色体上，其上携带的基因能在受体细胞中表达。Ti质粒随后被改造用作人工植物基因工程的载体。这种利用农杆菌的遗传转化体系，将外源目的基因或DNA片段插入Ti质粒的T－DNA中，并随之导入受体植物细胞，而获得转基因植株的方法，即为农杆菌介导法。

l

Ti质粒的必需组成元件，包括T－DNA区域和致毒基因(Virgene)Ti质粒为160～250kb的大质粒，包括毒性区(Vir区)、结合转移区(Con区)、复制起始区(Ori区)和T-DNA区4部分，其中与冠瘿碱生成有关的是Vir区和T-DNA区。前者大小为30kb，分virA-J等至少10个操纵子，决定了T-DNA的加工和转移过程。T-DNA可以将携带的任何基因整合到植物基因组中，但这些基因本身与T-DNA的转移和整合无关，仅左右两端各25bp的同向重复序列为其加工所必需，其中14bp是完全保守的，分10和4bp不连续的两组，两边界中以右边界更为重要。

（1）T-DNA

T-DNA区段的两端均有相似的25bp的特殊序列。TL

GGCAGGATATATTCAATTGTAAATTR

GGCAGGATATATCGAGGTGTAAAA

二、操作步骤

用农杆菌法转化受体植物的全过程包括：植物受体系统的建立Ti质粒转化载体系统的构建工程农杆菌的制备外源基因的转化转化体的筛选和转基因植株的检测第二节

基因枪法基因枪法又称微弹轰击法、粒子轰击法、高速粒子喷射技术、弹道微靶点射击，是一种借助高速金属微粒将DNA分子引入活细胞的转化技术。

一、原理基因枪技术的基本原理是利用火药爆炸、高压放电或高压气体作驱动力，将载有外源DNA的金（或钨）粉等金属微粒加速，射入受体细胞或组织，从而达到将外源DNA分子导入细胞中的目的。二、操作步骤1、受体细胞或组织的预处理通过渗透剂（甘露醇、山梨醇等）处理来调节受体细胞或组织的渗透压，维持细胞的高渗状态，使其在轰击受伤后细胞质的外渗减少，从而有利于细胞的成活。

2、DNA微弹的制备这一过程是将外源基因DNA分子以一定比例附着在金属微粒子（金粉或钨粉）载体上。3、受体材料的轰击PDS-1000/H台式基因枪

4、过渡培养与筛选培养轰击后的材料先在不含选择压力的培养基中过渡培养一段时间（一般1～2周），以利于受轰击材料的恢复并充分表达外源基因（包括选择压力抗性基因），再转入有选择压力的培养基中进行培养，以抑制非转化细胞的生长，而转化细胞则能继续生长分化，从而被筛选出来。第三节

聚乙二醇法一、基本原理聚乙二醇（PEG）是一种选择性化学渗透剂，它可以使细胞膜之间或使DNA与细胞膜之间形成分子桥，促使相互间的接触和粘连，并通过改变细胞膜表面的电荷，引起细胞膜透性变化，从而促进外源大分子进入原生质体，因此称之为PEG诱导法。

二、操作程序1、分离原生质体2、提取带有目的基因的质粒或其它外源DNA；3、取0.5ml新制备的原生质体悬浮液（原生质体密度为2X106/ml）,加入50μl小牛胸腺DNA，混匀后静置10分钟，然后再加入10ml外源DNA，轻轻混匀后静置10分钟；

4、加入等体积40％的PEG溶液，立即混匀，室温下置30分钟；5、每隔5分钟加1～2ml0.2mlCaCl2溶液，逐步稀释到10ml；6、离心收集原生质体，并重新悬浮培养到10ml培养基中培养1周；7、将原生质体转移到选择培养基中进行筛选培养。三、基本特点PEG法的优点如下：1．实验成本低，不需要特殊的仪器设备2．受体植物材料不受种类的限制，只要能建立原生质体再生体系的植物都可以采用此法；3．得到的转化体中嵌合体很少；

4．结果稳定，重复性好；5．有实验证明，此法可使两个非连锁基因的共转化率达50％左右；6．有研究表明，用植物总DNA进行转化，其转化频率与用质粒DNA接近；7．此法可与电击法、脂质体法、基因枪法、激光微束穿刺法等技术结合使用，可大大提高转化率。

但PEG法也有较大的局限性：1．必须以原生质体为受体，而建立原生质体再生体系往往十分困难；2．转化率仍然偏低。第四节

浸渍法一、基本原理浸渍法是将植物的种子、胚、胚珠、子房、花粉粒、幼穗、悬浮细胞甚至幼苗等直接浸泡在外源DNA溶液中，利用植物细胞自身的物质运输系统将外源DNA分子直接导入受体细胞。

现在已经证明植物细胞至少通过以下几种途径将外源DNA吸入细胞内：1、外源DNA可以通过细胞间隙与胞间连丝组成的网络化的运输系统而被运输到每一个细胞内；2、植物细胞通过类似于动物细胞的内吞作用将外源DNA摄入细胞内；3、植物组织中的传递细胞的膜透性改变可以为大分子物质透过细胞膜提供机会，尤其是生殖细胞以及分生细胞中，外源DNA进入细胞中的机会更大。

二、基本方法以种子为受体介绍其基本操作方法：1、将种子用0.1％的升汞或20％～30％次氯酸钠消毒，无菌剥去种皮（也可剥去幼胚）；2、将剥出的种子浸于无菌的0.1XSSC缓冲液中，加入20％的二甲基亚砜（DMSO）；3、加入供体DNA溶液（100～200μg/ml），浸泡30min至数小时；4、用无菌0.1XSSC缓冲液冲洗干净；

5、将种子放在无菌滤纸上吸干水份后，转入无激素的固体培养基上培养；6、将生长发育正常的胚转入筛选培养基上进行筛选（用质粒DNA浸泡的种子），或成苗后转栽到土壤中进行变异性状分析（用总DNA浸泡的种子）。

三、基本特点浸渍法具有如下优点：浸渍法是高等植物转化技术中最简单、快速、便宜的一种转化方法，它无需昂贵的仪器设备和复杂的组织培养技术，可以进行大批量的受体转化工作，容易推广。此法的局限性如下：转化频率较低，重复性较差，筛选和检测也困难，往往很难得到分子生物学证据。第五节

花粉管通道法一、基本原理在受精及胚胎发育的初期是植物接受远缘遗传物质的敏感时期，就生殖细胞的结构而言，在胚囊中的精、卵细胞类似天然的原生质体；而且在精子入卵时，卵膜有一个开闭的过程；即使到了合子期，胞壁的形成也尚未完备，胞壁的屏障作用还很小，因此外源基因进入受体卵细胞及合子的阻力较小。

在花粉管伸入胚珠的过程中可形成花粉管通道，这为外源DNA分子进入胚囊提供了天然的途径。植物授粉后外源DNA能沿着花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎。

就整体分子而言，亲缘关系愈远的生物间