第十一章 经典液相色谱法与检测技术

1第十一章经典液相色谱法与检测技术

◆学习目的⊙◆知识要求⊙◆能力要求⊙◆学习目的2通过学习色谱法基本概念、基本类型、分离机制以及各种经典液相色谱法的固定相、流动相及其选择等相关知识。了解色谱法的特点及其应用，会利用吸附色谱、分配色谱等经典柱色谱法和薄层色谱法对试样进行分离分析。为气相色谱法和高效液相色谱法的学习奠定基础，同时也为学习药物分析、天然药物化学、药物分离检测技术等专业课程奠定基础。◆知识要求31.掌握色谱法的基本概念，吸附色谱法和分配色谱法的分离机制，薄层色谱法的基本原理及其应用。2.熟悉色谱法的分类，离子交换色谱法和凝胶色谱法的分离机制，各种经典的柱色谱法基本原理及其应用。3.了解色谱法的由来和发展。⊙◆能力要求熟练掌握薄层色谱法、柱色谱法的操作技术，学会应用薄层色谱法等对物质进行分离和鉴定。

4⊙案例导入为什么采用这种方法可以使得这些性质相似的物质得以分离？固定相（布或纸片）和不断加入的溶液对组分的分离起到什么作用，两者如何选择？分离后的各组分怎样定性和准确检出……？5古罗马时代人们将一滴含有混合色素的溶液滴到一块布(或纸片)上，随着溶液的扩展，在布（或纸片）上会呈现一个一个的同心圆环，人们通过观察这些同心圆环的差异来分析染料和色素。第一节概述

色谱法（chromatography）是一种根据物质的物理或物理化学性质不同而进行分离分析的方法。6色谱法和其他方法相比较具有下列特点：1.分离效能高2.灵敏度高3.应用范围色谱法——起源真正意义的色谱实验色谱法的创始人是俄国植物学家Tsweet。一、色谱法产生与发展流动相固定相被分离后，代表了不同组分的色带色谱柱第一节概述

色谱法——发展柱色谱—20世纪初；趋势：新型固定相和检测器及各种检测技术的联用薄层、纸色谱—20世纪30～40年代；气相色谱—20世纪50～60年代；高效液相色谱—20世纪70年代；超临界流体色谱法

毛细管电泳法……20世纪80年代初第一节概述

第一节概述（一）按两相的分子聚集状态分类9色谱总称流动相固定相色谱名称液相色谱法（LC）液体固体液—固色谱法（LSC）液体液—液色谱法（LLC）化学键合相化学键合相色谱法（BPC）气相色谱法（GC）气体固体气—固色谱法（GSC）液体气—液色谱法（GLC）超临界流体色谱法（SFC）超临界流体固体或化学键合相二、色谱法的分类第一节概述10（二）按操作形式分类

色谱名称柱色谱（CC）平面色谱填充柱色谱法毛细管柱色谱法薄层色谱法（TLC）纸色谱法（PC）固定相形式填充柱毛细管柱薄层板纸在玻璃或金属管内填充或涂覆满固定相在弹性石英或玻璃毛细管内壁覆有吸附剂薄层或固定液在玻璃或金属板上涂布吸附剂等固定相具有多孔和强渗透能力的滤纸或纤维素薄膜色谱过程流动相由柱头向柱尾不间断冲洗流动相从板或纸的一端向另一端扩展二、色谱法的分类第一节概述第一节概述11（三）按色谱过程的分离机制分类吸附色谱法（AC）分配色谱法（DC）离子交换色谱法（IEC）凝胶色谱法（SEC）……二、色谱法的分类色谱法分类小结1213课堂互动请您阐述色谱法的分类方法，及各种色谱法的特点？第一节概述第一节概述第一节概述（一）分配系数和容量因子1.分配系数（K）142.容量因子（k）三、色谱法的基本原理第一节概述第一节概述153.分配系数与容量因子的关系

称为相比，在一定色谱条件下为定值；Vm为柱中流动相体积（近似等于第十二章中提及的死体积）；Vs

是柱中固定相（或固定液）的体积；κ值随β

和K

的变化而变化。（一）分配系数和容量因子第一节概述分配系数（或容量因子）越小，组分的迁移速度越快，保留时间越短，即先流出色谱柱；反之亦然。

分配系数（或容量因子）不等是组分分离的前提。

164.分配系数、容量因子与保留值的关系

课堂互动请您分析：组分的分配系数

，与组分在固定相中的停留时间之间存在什么关系？第一节概述（一）分配系数和容量因子（二）色谱过程的分离机制

组分不断被吸附、解吸附，如此反复多次的过程。组分的吸附平衡常数越大，越容易被吸附，迁移速度就越慢。吸附平衡常数17图11-2吸附色谱分离机制示意图吸附剂组分分子流动相分子被解吸的组分分子被解吸的流动相分子1.吸附色谱法分离机制第一节概述（二）色谱过程的分离机制18流动相携带样品流经固定相时，各组分在两相间不断地进行溶解、萃取，再溶解、再萃取的过程分配系数大的组分移动速度慢，分配系数小的组分移动速度快。进入固定相的组分分子进入流动相的组分分子固定相2.分配色谱法分离机制图11-3分配色谱分离机制示意图第一节概述（二）色谱过程的分离机制3.离子交换色谱法分离机制19被分离的离子随流动相流经离子交换树脂时，与离子交换树脂上可被交换的离子连续进行竞争交换，交换能力弱的离子，迁移速度快，保留时间短，先流出色谱柱。离子交换剂Θ固定离子组分离子⊕可交换阳离子图11-4阳离子交换色谱分离机制示意图第一节概述第一节概述以阳离子为例，离子交换反应的通式用下式表示：20选择性系数KA/B用于衡量离子对树脂的亲和能力。KA/B越大（KA/B>1），说明A＋的交换能力大，保留时间长，则A＋比B＋后流出色谱柱；反之亦然。离子交换达到平衡时以浓度表示的平衡常数为：3.离子交换色谱法分离机制（二）色谱过程的分离机制4.凝胶色谱法分离机制21凝胶色谱分离机制示意图O：凝胶颗粒o：大分子组分·：小分子组分组分的分离取决于凝胶颗粒的孔径大小和被分离物质分子的大小。出柱顺序：首先是大分子，其次是中等大小的分子，最后是小分子。第一节概述角度不同，对色谱法的分类不同。色谱法中分配系数（或容量因子）不等是组分分离的前提。中分配系数（或容量因子）越大，组分在固定相中的保留时间越长；反之亦然。凝胶色谱法中分子的尺寸（分子量）越小在固定相中的保留时间越长；反之亦然。点滴积累

22第一节概述23第二节柱色谱法柱色谱法是指将固定相填覆在玻璃管或不锈钢管柱中的色谱法。经典柱色谱法的流动相是液体，固定相可以是吸附剂、液体，也可以是离子交换树脂、凝胶等。一、液—固吸附柱色谱法24第二节柱色谱法固定相：吸附剂，是一些多孔性微粒物质，具有较大的比表面积和多个吸附中心，其吸附性能取决于吸附中心的多少及其吸附能力的大小。常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、聚酰胺、大孔吸附树脂、活性炭等。一、液—固吸附柱色谱法1.固定相（1）硅胶（SiO2·XH2O）25硅胶的吸附活性与含水量有关。第二节柱色谱法硅胶含水量（%）活性级数活性氧化铝含水量（%）0Ⅰ高低05Ⅱ315Ⅲ625Ⅳ1038Ⅴ15表11-3硅胶和氧化铝的活性与含水量的关系硅胶呈微酸性，主要用于分离酸性和中性化合物。

硅胶活性级数和活性及吸附能力间的关系：硅胶的活性级数是根据其含水量高低确定。硅胶的活性是根据其吸附能力强弱确定。硅胶的含水量越高，活性级数越高，越多的硅醇基因为形成水合硅醇基，而使得硅胶吸附其他物质的能力下降，即硅胶的吸附性能下降，活性低。26难点释疑第二节柱色谱法27（2）氧化铝：吸附能力略高于硅胶，分离能力强，活性可以控制。氧化铝的吸附活性与其含水量密切相关。一、液—固吸附柱色谱法1.固定相氧化铝可分为酸性、中性、和碱性三种，其中中性氧化铝应用广泛。第二节柱色谱法酸性氧化铝（pH4～5）用于分离酸性化合物以及对酸稳定的中性化合物。碱性氧化铝（pH9～10）用于分离碱性和中性化合物。中性氧化铝（pH≈7.5）凡是酸性、碱性氧化铝上能分离的化合物，中性氧化铝都能分离。28一、液—固吸附柱色谱法（2）氧化铝第二节柱色谱法（3）聚酰胺：是一类由酰胺聚合而成的高分子化合物，常用的是聚己内酰胺。

聚酰胺主要通过分子中的酰氨基或羰基与化合物质子给予体形成氢键而对被分离组分产生吸附。聚酰胺在天然药物有效成分的分离方面应用广泛。29一、液—固吸附柱色谱法1.固定相第二节柱色谱法（4）大孔吸附树脂：是一种不含交换基团，但具有大孔网状结构的高分子化合物。通过范德华引力或产生氢键对被分离物质产生吸附。

大孔吸附树脂的选择性由多孔性网状结构所决定。大孔吸附树脂主要用于水溶性化合物的分离及纯化。30一、液—固吸附柱色谱法1.固定相第二节柱色谱法第二节柱色谱法2.被测物质的结构与性质31不同类型的化合物极性由小到大的顺序为：烷烃＜烯烃＜醚类＜硝基化合物＜酯类＜酮类＜醛类＜硫醇＜胺类＜醇类＜酚类＜羧酸类一、液—固吸附柱色谱法第二节柱色谱法判断物质极性强弱时，可以参考以下规律：①基本母核相同，分子中极性基团的极性越大、极性基团越多，则分子的极性就越大；②分子中双键越多、共轭双键链越长，极性越大；③分子式相同，能形成分子内氢键的分子极性要弱；④在同系物中，分子量越大，分子的极性越小。322.被测物质的结构与性质一、液—固吸附柱色谱法第二节柱色谱法3.流动相性质常用溶剂的极性由小到大的顺序为：石油醚＜环己烷＜四氯化碳＜苯＜甲苯＜乙醚＜三氯甲烷＜乙酸乙酯＜正丁醇＜丙酮＜乙醇＜甲醇＜水33一、液—固吸附柱色谱法第二节柱色谱法（1）吸附剂的选择：分离极性大的物质，一般选用吸附活性小的吸附剂；反之亦然。即使得吸附剂与被分离物质间存在适宜强度的吸附作用力。344.吸附剂和流动相的选择一、液—固吸附柱色谱法（2）流动相的选择：“相似相溶”原则进行选择。第二节柱色谱法35被测物质的极性、吸附剂活性和流动相极性之间的关系示意图

一、液—固吸附柱色谱法一般用亲水性吸附剂（如：硅胶）作色谱分离时，若分离物极性较小，应选择何吸附剂和洗脱剂？分离物极性小，形成氢键的能力弱，所以宜选用吸附活性大（含水量低即活性级数低）的吸附剂，这样分离物和吸附剂间才能形成一定强度的氢键，使固定相对其产生适宜的吸附作用；被分离物极性小，根据“相似相溶”原则宜选用极性小的洗脱剂。36案例分析第二节柱色谱法第二节柱色谱法二、液—液分配柱色谱法1.固定相由载体及涂渍或键合在载体表面的固定液组成。37载体是一种惰性物质，主要起负载或支撑固定液的作用。固定液正相色谱：强极性溶剂，如水、甲醇等。反相色谱：非极性或弱极性溶剂，如液体石蜡等。第二节柱色谱法2.流动相

正相色谱：极性小于固定相的醇类、酮类、酯类、卤代烷、苯或其混合物。

反相色谱：水、稀醇等极性溶剂。应用各类化合物的分离，特别是亲水性物质。38二、液—液分配柱色谱法

分配色谱分离时，已知某混合物中A、B二组分在两相中的分配系数分别为315、450，请您分析，进行柱色谱分离时二组分的出柱顺序。39课堂互动二、液—液分配柱色谱法第二节柱色谱法第二节柱色谱法1.固定相

离子交换树脂40交联度：离子交换树脂中所含交联剂的量。用于衡量离子交换树脂的选择性，交联度大，树脂的网状结构紧密，网眼小，选择性好。交换容量：实验条件下，每克干树脂真正参加交换的活性基团数。用于衡量离子交换树脂的交换能力，交换容量大，树脂的交换能力强。三、离子交换柱色谱法第二节柱色谱法2.流动相水为溶剂的缓冲溶液。应用去离子水的制备，天然药物化学成分的分离。41三、离子交换柱色谱法第二节柱色谱法四、凝胶柱色谱法1.固定相选择时应使试样的相对分子量落入凝胶的相对分子质量范围内。42（1）排斥极限：化合物的相对分子质量达到某一数值后就不能渗透进入凝胶的任何孔穴，这一数值称~。（2）全渗透点：化合物的相对分子质量小于某一数值后就能进入凝胶的所有孔穴，则这一数值称~。（3）相对分子质量范围：排斥极限与全渗透点之间的相对分子质量范围称为~。第二节柱色谱法第二节柱色谱法应用天然药物化学和生物化学的研究，水溶性高分子化合物如蛋白制剂等的分析。432.流动相一般水溶性试样选择水溶液为流动相，而非水溶性试样则选择四氢呋喃、氯仿、甲苯等有机溶剂为流动相。四、凝胶柱色谱法第二节柱色谱法五、柱色谱法的应用例如采用柱色谱法中的凝胶色谱法，以葡聚糖凝胶为固定相，1mol/L的NaCl为流动相，可以将分子量存在差异的葡萄糖和淀粉进行分离。例如采用分配色谱法以硅胶为固定相，水饱和的乙酸乙酯为流动相，可以将洋地黄毒苷、羟基洋地黄毒苷、异羟基洋地黄毒苷三种单体进行分离等。44点滴积累1.硅胶（或氧化铝）活性级数高，活性低，吸附能力弱。2.吸附柱色谱法：被分离组分与固定相间的吸附作用力适中；组分与流动相“相似相溶”。3.分配柱色谱法：固定相与流动相极性不同，且不互溶；适于各类化合物分离，特别是亲水性化合物分离4.离子交换柱色谱法：分子量较小的样品宜选择交联度大的树脂，分子量较大的样品宜选择交联度小的树脂；常选用水为溶剂的缓冲溶液做流动相。5.凝胶色谱法：样品的分子量范围落入凝胶的相对分子质量范围内；常选用水溶剂或非水溶剂做流动相。45第二节柱色谱法第三节平面色谱法一、基本原理（一）分离原理薄层色谱法：将固定相（如：吸附剂）均匀地涂铺在光洁的玻璃板、塑料板或金属板上形成薄层，在薄层板上进行分离分析的方法。分离机制与吸附柱色谱的分离机制相似。46第三节平面色谱法（二）比移值与相对比移值

47比移值（Rf）：

L0原点溶剂前沿ABL1L2Rf的测量示意图

Rf可用范围是0.2～0.8，最佳范围是0.3～0.5。

第三节平面色谱法48相对比移值（Rr）

Rr可以大于1，也可以小于1。，

L0原点溶剂前沿ABL1L2Rf的测量示意图第三节平面色谱法491.已知A与参考物质B的相对比移值为1.2，当B物质在一定色谱条件下，在某薄层板上展开后，斑点距原点6cm，此时溶剂前沿到原点的距离为18cm，若A也在此薄层板上同时展开。请分析A在薄层板的何位置，A物质的比移值是多少？2.分别说明什么？课堂互动第三节平面色谱法第三节平面色谱法

二、吸附剂的选择50与吸附柱色谱法所用的吸附剂相似，其主要区别在于薄层色谱法所用的吸附剂颗粒更细小。

三、展开剂的选择遵循“相似相溶”原则。

薄层色谱中常用的溶剂按极性由弱到强的顺序是：石油醚＜环己烷＜二硫化碳＜四氯化碳＜三氯乙烷＜苯＜甲苯＜二氯甲烷三氯甲烷＜苯＜甲苯＜二氯甲烷＜三氯甲烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜丙酮＜正丙醇＜乙醇＜甲醇＜吡啶＜水第三节平面色谱法51在苯-乙醇（9׃1）展开剂中，您知道苯、乙醇的作用吗？吸附薄层色谱实验中以硅胶板为薄层板，环己烷为展开剂，若某极性组分Rf=0

，请分析应如何调整展开剂的极性？课堂互动第三节平面色谱法四、操作方法

薄层色谱法的操作可分为制板、点样、展开、显色与检视、系统适用性试验和测定六个步骤。

52第三节平面色谱法薄层板：

分为硬板软板，荧光薄层板等。53符号含意符号含意G以石膏作粘合剂C薄层已被分成条带H无外加粘合剂Silanised,RP-2二甲基硅烷改性的反相R特别纯化的RP反相P制备用RP-8，RP-18C-8，C-18烷基改性W水可湿性的NH2氨基改性亲水层F254,366荧光指示剂激发波长CHIR手性固定相F254S抗酸性荧光指示剂CN氰基改性固定相40,60……平均孔径（Å）DIOL二醇基改性固定相市售吸附剂和预制板包装上的符号及含意引自/books/C/1