一种过氧化物及角质酶联合处理聚乙烯的方法

一种过氧及角酶联合处乙烯方法1.本发明涉及种过氧化物及角酶联合处理聚乙烯方法，属于环境学、材料学及酶工程域。背技：2.聚乙烯是由碳单键做为骨架接而成的高分子聚物，是最简单的烯烃类高聚物，在日生活被广泛使用然而，伴随的后是聚烯烃垃圾的广分布以及其对生态统和生物健康带的巨大压力。因，聚乙烯垃圾的降一直是困扰全球的题。相较于物理化学方法，生物在降解聚烯烃方面现出耗能低、环保优势。3.由于碳碳单较高的键能(330–370kjmol-1)，生物酶催化聚烯降解需要先行活化。目前，化处理手段主要括uv、强酸强碱无机氧化剂的处，生成的官能团主为羟基、羰基、碳双键等。在上述预理的基础上，目已报到了部分氧还原酶能够降解聚烯。如漆酶(lac)能够降uv氧化聚乙烯，重均分子损失约20％；木质素过氧化物酶(lip)及过氧化物酶(mnp)能够在黑介质下降解k2cr2o7氧化的聚乙烯；乳胶清除白(lcp)催化uv氧化的聚烯后重均分子量失约42.02％。上述预理方式虽能有效高生物酶的降解作，但是目前并未研究明确这些酶的用含氧基团降解乙烯的机制。技实要素：4.针对目前存的问题，本发明一种过氧化物及角酶联合处理聚乙的方法，所述方法先用间氯过氧苯甲(mcpba)催化baeyer-villiger反应向聚乙烯的主链碳碳单上添加酯键，再用thermobifidafusca来源的质酶催化水解反应降解所酯键，从而达到解聚乙烯的目的5.在一种实施式中，所述间氯氧苯甲酸与聚乙烯(ldpe)质量比为(1～5)：1。6.在一种实施式中，所述thermobifidafusca源的角质酶具有seqidno.1所示的氨酸序列。7.在一种实施式中，所述角质的催化时间≥1天，5天或7天。8.在一种实施式中，所述方法括如下步骤：9.(1)将ldpe解于1,3,5-三氯苯-二氯乙烷合溶液，80～120℃搅拌溶10～14h；添加mcpba并80～120℃催化～10h；加入甲醇沉淀ldpe过滤，再用甲醇洗3-4次去除溶剂，烘至恒，获得含酯键的化聚乙烯；10.(2)将步骤(2)备的含酯键的氧聚乙烯加入至角质酶液中，于55～65℃反应至少天。11.在一种实施方中，所述1,3,5-三氯苯-二氯乙烷合溶液是以等体积将1,3,5-三氯苯和二乙烷混合制成。12.在一种实施方中，所述ldpe以1:(10～20)的比溶解于1,3,5-三氯苯-二氯乙烷混合溶。gmhh(s)ht2与tskgelhfrc串联色谱柱及tskguardcolumnh(s)ht2(21489)保护，检测温度145℃，进样量300μl，脱溶液1,2,4-二氯苯，洗脱时间50min洗脱流速1.0ml/min。27.酶活的检测方：28.tris-hcl缓液(10mmph7.0)：准确称tris1.210g、nacl0.584g加入约800ml去离子，充分搅拌溶解用hcl调节ph至8.0，定容至1000ml。29.底物(50mmol/l的对基苯丁酸酯溶液)：准确称0.1046g对硝基苯丁酸酯，用乙腈定容10ml，-20℃保存。30.对硝基苯酚标曲线的制作：称13.9mg对硝基苯酚，用10mmph7.0tris-hcl缓液定容至1000ml，配制成100μmol/l的硝基苯酚母液再用10mmph7.0的tris-hcl缓冲液稀释至0、20、4060、80、100μmol/l用0.5cm玻璃比色在分光光度计上定波长为405nm时的吸光值，以硝基苯酚浓度c为横坐，吸光值a为纵坐标，绘制标曲线a＝a×cb。31.用5ml的移液准确移取1.5mltris-hcl缓冲液(37提前温育10min)至0.5cm玻璃比色中，在吸收波长405nm处零。取1.44mltris-hcl缓冲液至0.5cm石英比色中，取30μl待测稀释酶液加上述石英比色皿，取30μl底物溶液加入上述石英比色中，摇匀后立即入可见分光光度计中，在吸收波长405nm处a值。每隔5秒记录一次a值，反应时为1分钟。32.计算：[0033][0034]式中：k：酶反应测不同时间a值和时间(min)所成线的斜率；[0035]v1：反应体积(ml)；[0036]v2：加酶量(ml)[0037]n：稀释倍数。[0038]酶活定义为在65℃ph8.0的环境下，每min催化对硝基丁酸酯水解生成1μmol所对硝苯酚的酶量为一酶活单位(u)。[0039]实施例1：t.fusca角质酶的制备[0040](1)将合成的如seqidno.2所的角质酶核苷酸列通过限制性内酶插入至pet24a的ndeⅰ位和xhoⅰ位点之间，得到重质粒pet24a-tfc；再构建的重组质粒pet24a-tfc转至大肠杆菌(escherichiacoli)jm109，到转化产物；将转化产涂布在lb固体培养基(含40μg/ml卡那霉素)上于37℃恒温培养箱中倒培养8～12h，得到转化子挑取转化子接种至lb液体培养基中，于37℃120～180rpm的条件下摇瓶养8～12h后提取质粒行测序验证，验证正确的株于30％甘油中保藏。[0041](2)将步骤(1)得的表达t.fusca角质酶重组大肠杆菌按0.1％的接量接种于10mllb液体养基中，加入40ngμl-1的卡那霉素。在37，200rpm条件下培养8-12h后，照5％接种量转于50mltb培养基，加入40ngμl-1卡那霉素。在37℃200rpm条件下培养2h至od600＝0.8后添加iptg至浓度为0.4mm，再置于25℃恒温养48h。8000rpm，15min离心后上即为粗酶液，酶活110.1u/ml。[0042]实施例2间氯过氧甲酸氧化处理聚烯[0043](1)体系优化[0044]利用mcpba对聚乙进行预处理，针1,2,4-tcb及dce混合溶液溶解ldpe进行氧化处理。体步骤为：(1)将50g/lldpe溶于以1:1的体积混合的1,3,5-三氯苯-氯乙烷混合溶液于100℃搅拌溶解12h；(2)添加mcpba并在100℃催化8h(3)加入等体积甲醇淀ldpe并过滤，之后用甲醇洗涤3-4次去除溶剂，后续样品放置在烘箱烘至恒重，所得品即为含酯键的氧聚乙烯。[0045]其中，步骤(2)分设计ldpe：mcpba的质量为1:1、1:4、1:5。[0046]分别测定反应结后的氧化聚乙烯品的分子量，结显示，催化剂比例1:1、1:4、1:5所备的氧化聚乙烯样的重均分子量分为26936da、11053da及7121da数均分子量分别2033da、581da及214da。[0047](2)对ldpe：mcpba的质比为1:5的产物测[0048]按照如下步骤制含酯键的氧化聚烯：将50g/lldpe溶解于以1:1的体积比混合的1,3,5-氯苯-二氯乙烷混合溶液，100℃搅拌溶解12h；(2)添加mcpba，使mcpba与步骤(1)入的ldpe的比为5：1，再于100℃催化8h；(3)加入等体积甲沉淀ldpe并过滤，之后用醇洗涤3-4次去除溶剂后续将样品放置在烘中烘至恒重，获被催化为淡黄色末的含酯键的氧化乙烯。ft-ir结显示，与聚乙烯比，氧化聚乙烯品中检测到1770-1640cm-1的-c＝o伸缩，且该峰为双峰峰值为1738cm-1及1711cm-1，分别对应酯羰和酮羰基。1hnmr结果显样品中不同官能团比例为a:e:k＝22:36:42，tf＝4.36。ht-gpc果显示，与聚乙相比，氧化聚乙烯的重均分子量及均分子量均有显降低(mw＝7121；mn＝214)。上结果表明，mcpba催体系能够使聚乙在溶解状态下进碳碳单键的活化，加含氧官能团(羟基、基及酯键)。[0049]实施例3：thermobifidafusca来源的角质酶处理化聚乙烯[0050](1)体系优化[0051]将实施例1步骤2)中获得氧化聚乙烯做为底物t.fusca角质酶加酶量4200u/g氧化聚烯，在60℃，150rpm条件分别反应1d、3d或7d。将催化结束后，于500目龙网过滤得到产样品依次使用2％(w/v)sds、去离子水、75％乙醇别超声处理30min，放置在烘中烘干得到角质处理后的氧化聚乙烯。分别定反应结束后的化聚乙烯样品的均分子量，结果显，反应时间分别为1d3d及7d所制备的氧化聚乙烯品的重均分子量别为4862da、4257da3779da，数均分子量分别29da、27da及33da。[0052](2)产物检测[0053]对处理7d后的解产物进行检测与氧化聚乙烯相比降解产物的颜色较氧化聚乙烯更深ft-ir结果显示，1650-1550cm-1及3700～3000cm-1范围内出现羧酸及羟基吸收峰，质酶处理的氧化乙烯中1770-1640cm-1的-c＝o伸缩中酯羰基低于酮基，而氧化聚乙中二者含量接近。时，1hnmr显示角酶处理后的氧化乙烯中不同官能比例a、e、k为28:28:44，tf3.95。相较于氧化聚乙烯角质酶处理的氧聚乙烯中酯键含量降低。1hnmr的果进一步证明了cpbape中的部分酯被角质酶水解产了新的物质。ht-gpc结果显示角酶处理的氧化聚乙烯重均子量相较于氧化乙烯降低至47.4％。整体而言，t.fusca角质酶能够与氧聚乙烯中的酯键生水解反应并有降低其重均分子量但是核磁结果显示存在酯键未降解这可能是由于t.fusca角质酶无与氧化聚乙烯内部存在的酯键接触[0054]表1聚乙烯、氧化乙烯及角质酶处后样品的ht-gpc和1hnmr检测果[0055][0056]实施例4：间氯氧苯甲酸联合thermobifidafusca来源角质酶处理聚乙[0057]具体步骤为：[0058](1)将50g/lldpe溶于以1:1的体积比混合的1,3,5-氯苯-二氯乙烷混合溶液，于100℃拌溶解12h；添加mcpba，mcpba与加入的ldpe的比例为(1～5)：1，再于100℃催化8h；加入等体积醇沉淀ldpe并过滤，之用甲醇洗涤3-4次去除剂，后续将样品置在烘箱中烘至恒，获得含酯键的化聚乙烯。[0059](2)将步骤(1)获得氧化聚乙烯为底物，t.fusca角质酶加酶量为4200u/g氧化聚乙烯，在60℃150rpm条件下反1～7d。将催化结束后于500目尼龙网过滤得到产样品依次使用2％(w/v)sds、去离子水、75乙醇分别超声处理30min，放在烘箱中烘干得到质酶处理后的氧聚乙烯。结果显示质酶处理的氧化乙烯重均分子量较于氧化聚乙烯低约33.8％～47.4％。[0060]虽然本发明已以佳实施例公开如上，但其非用以限定本发，任何熟悉此技术的人，在不离本发明的精神范围内，都可做种的改动与修饰，此本发明的保护范应该以权利要求所界定的为准。技特：1.一种聚乙烯含聚乙烯的产品方法，其特征在于采用过氧化物及质酶联合处理聚乙烯含聚乙烯的产品所述方法先使用氯过氧苯甲酸催化baeyer-villiger反应聚乙烯的主链碳单键上添加酯，再使用thermobifidafusca来源角质酶催化水解应降解所述酯键。2.根据利要求1所述的方法，特征在于，所述氯过氧苯甲酸与聚烯的质量比为(1～5)：1。3.根据权要求1或2所述的方法，特征在于，所述质酶具有seqidno.1所示的基酸序列。4.根据权利要1～3任一所述的方法，其征在于，所述角质酶催化时间≥1天，5天或7天。5.根权利要求1或3所述的方法，其特征在，所述方法包括下步骤：(1)将ldpe溶解于1,3,5-三氯苯-二氯乙烷混合溶，80～120℃搅拌溶解10～14h添加mcpba并在80～120催化6～10h；加入甲醇沉ldpe并过滤，再用甲醇洗3-4次去除溶剂烘至恒重，获得含键的氧化聚乙烯(2)将步骤(2)制备的含酯键的氧化聚烯加入至角质酶液中，于55～65℃反应至少1天。6.根权利要求5所述的法，其特征在于步骤(1)所述1,3,5-三氯苯-二氯烷混合溶液是以等体比将1,3,5-三氯苯和二氯烷混合制成。7.根据权利求5所述的方法，其征在于，步骤(1)所述所述ldpe1:(10～20)的比例解于1,3