考马斯亮蓝g-250染色法测定草乌药材中可溶性蛋白质含量

考马斯亮蓝g-250染色法测定草乌药材中可溶性蛋白质含量

草籽是属于毛科的一个干燥的区域。记录始于神农本草经，也被称为北口。它是毛科植物。具有消除风、除湿、循环、止痛的功效。风、关节、关节痛、全身疼痛、麻醉、止痛等疾病已在国内外公众中进行过多的研究。它主要用于化学成分中生物成分、加工技术、机制、药理学、病理、病理、临床等。然而，关于草籽的蛋白质含量没有报告。根据测定重金属含量、农残含量、碱化剂含量和养分含量的基础，测定了草籽中的蛋白质含量。通过分析蛋白质含量，了解蛋白质含量的情况，为草籽材料资源评价提供参考依据。近年来,基因工程学、分子生物学和现代分离技术快速发展,蛋白质也作为一项质量和资源评价的指标,但是部分植物中蛋白质含量很低且纯化相当困难,不易获得,而其蛋白质含量必需明确,故探索测定蛋白质含量的方法有重要的意义.目前测定蛋白质含量的常用方法主要有凯氏定氮法、考马斯亮蓝(CBB)染色法、紫外分光光度法、双缩脲法、Folin-酚试剂法(Lowry法),其次双辛可宁酸(BCA)法、银染法、荧光法(灵敏度一般较低)的报道.有关文献报道CBB法优于其他的方法,蛋白质测定仪法.鉴于草乌中蛋白质含量较低的特点及文献报道CBB染色法与其它方法相比,具有消耗蛋白质量小、灵敏度高、受外界因素影响小的优点,下面采用CBB染色法测定草乌中低浓度蛋白质含量.1乙醇与乙醇的反应UV-2450紫外分光光度计;牛血清白蛋白进口分装;考马斯亮蓝G-250进口分装(上海新兴化工试剂研究所批号031108);95%乙醇;80%H3PO4;草乌药材来源1河北承德、2安徽亳州、3安徽亳州、4贵州、5河南南召(采集)、6辽宁千山、7云南文山(采集)、8河南确山(采集)、9四川(采集)、10内蒙古等地.药材经中国科学院昆明植物所标本馆李锡文研究员鉴定,拉丁名称:AconitumKusnezoffiiReichb.,中文名称:北乌头.2标准溶液和样品溶液的制备2.1蛋白质标准储备液mg准确称取牛血清白蛋白100.00mg用少量蒸馏水溶解,定容至1000mL,此即为100μg/mL蛋白质标准储备液,冰箱中保存.2.2h3po100mlw/vh3po100ml红色精密称取考马斯亮蓝G-250100.00mg,加入95%乙醇50mL(蓝色),再加入85%(W/V)H3PO4100mL(血红色)最后用蒸馏水定容至1000mL(褐色)常温下放置一个月后不能再使用.2.3制备无氟提取液制备称取干燥样品0.5g,加少量石英砂用蒸馏水研磨成匀浆定容至100mL,静置10～30min(3～5min,摇动一次)过滤(如含色素可用活性炭脱色),滤液定容至100mL备用.3方法研究3.1吸光度线性回归分析见表1,以蛋白质含量(X)为横坐标以吸光度(A)为纵坐标进行线性回归分析,线性回归方程为:A=1.5957X-0.0046r=0.9985.3.2精密度测试精密称取(1号)样品0.5006g按“供试品溶液制备”及“标准曲线的绘制”项下操作,分别测定吸收度,求得RSD=2.8%.3.3重复试验精密称取样品5份,按“供试品溶液制备”和“标准曲线的绘制”项下操作分别测定吸收度,RSD=1.4%.3.4加标回收率测定精密称取已知含量的样品(1号)5份,分别加入一定量的蛋白质对照品储备液.按“供试品溶液制备”和“标准曲线的绘制”项下操作,测定吸光度.平均回收率为99.4%,RSD=1.5%.3.5标准曲线的绘制精密称取(1号)样品0.5006g按“供试品溶液制备”及,“标准曲线的绘制”项下操作,每隔一定时间测定一次吸收度.结果表明,在显色3h内吸光度无变化,RSD=2.8%.3.6蛋白质含量测定取干洁试管2支,1支加入“供试品溶液的制备”项下1mL待测液,1支加1mL蒸馏水(做空白)按“标准曲线绘制”项下操作,测定吸光度,记录数据.计算蛋白质含量,计算结果见表2.4考马斯亮蓝g-200染色法在草乌中的应用(1)考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量原理是属于染料结合法的一种,存在红色与蓝色两种不同的颜色形式.该染料在游离状态下呈红色,在稀酸溶液中与蛋白质的疏水区结合时变为蓝色,前者最大吸收波长在465nm,后者在595nm.在一定蛋白质浓度范围内(1～1000μg),蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比(符合郎贝比尔定律),故可以用于蛋白质含量测定.(2)为了验证考马斯亮蓝G-250染色法的准确性,我们进行了重复试验,对每个样品测定4次,求得每个样品的平均值及RSD值,蛋白质的含量在3.13±0.01～9.81±0.06mg/kg的范围,平均值为6.71±0.03mg/kg,由RSD=2.7%可知,结果是比较稳定的,蛋白质浓度在线性0.02～0.1mg/kg范围内,考马斯亮蓝G-250染色法