分子生物学：G H 基因操作

SectionG&HGenemanipulation基因操作

DNACloningDNAcloninginvolvesseparatingaspecificgeneorsegmentofDNAfromitslargerchromosomeandattachingittoasmallmoleculeofcarrierDNA,thenreplicatingthismodifiedDNAthousandsorevenmillionsoftimes.DNAcloning(definition)

DNAcloningistoplacearelativelyshortfragmentinanautonomouslyreplicatingpieceofDNA,knownasavector，formingrecombinantDNA,whichcanbereplicates.PropagationofthehostorganismcontainingtherecombinantDNAformsasetofgeneticallyidenticalorganism,oraclone.ThisprocessiscalledDNAcloning.在基因工程的实际操作中，工具酶的使用是一项基本技术。在体外对DNA进行分离纯化、连接重组或者修饰合成等，都会涉及一系列酶促反应。用于基因工程的工具酶种类繁多一、工具酶根据底物分类：DNase、RNase；单链核酸酶、双链核酸酶、杂合双链核酸酶根据催化部位分类：核酸外切酶和核酸内切酶外切酶：5´端→3´端或3´端→5´端核酸外切酶。内切酶：限制性核酸内切酶和非限制性核酸内切酶。1.核酸酶的分类限制性核酸内切酶(restrictionendonucleases)：能够识别DNA分子的特定核苷酸序列，并在识别位点或其周围断开DNA双链的一类核酸酶。三种类型限制酶的主要特性差异比较距识别序列下游24-26bp处识别序列内或附近特异性切割距识别序列1kb处随机性切割切割位点GAGCCCAGCAG旋转对称序列TGAN8TGCTAACN6GTGC识别序列ATP、Mg2+、SAMMg2+ATP、Mg2+、SAM

辅助因子异源二聚体同源二聚体异源三聚体蛋白结构双功能单功能多功能限制修饰

Ⅲ型Ⅱ型I型主要特性I型不能用，Ⅲ型酶基本不用，Ⅱ型酶最有用1.2限制性核酸内切酶作用特点来源细菌，只水解外源DNA，可阻止噬菌体对细菌的感染；专一性极高，选择5－8核苷酸特定序列，切口的序列为回文结构；产生的切口大多为粘性末端，少数为平头末端。1.3限制性内切酶的命名以EcoRⅠ为例：第一字母：斜体大写，来自菌种属名的第一字母；第二、三字母：斜体小写，来自菌种种名前两个字母；第四字母：正体大写，菌株名的第一字母；第五字母：正体大写，该酶发现的次序。EscherichiacoliRY13株发现的第一种酶→EcoRⅠEcoRⅠ切割位点：

5'-GAATTC-3'

3'-CTTAAG-5'序列，切割位点在G与A之间，形成黏性末端。同裂酶（Isoschizomers)：识别位点的序列相同的限制性内切酶。完全同裂酶识别位点和切点完全相同。如HindⅢ

和HsuI。HindⅢ5’-A

AGCTT-3’3’-TTCGA

A-5’HsuI5’-A

AGCTT-3’3’-TTCGA

A-5’1.4同裂酶与同尾酶XmaI5’-C

CCGGG-3’3’-GGGCC

C-5’SmaI5’-CCC

GGG-3’3’-GGG

CCC-5’识别位点相同，但切点不同。如XmaI和

SmaI。不完全同裂酶识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等。5’-G

GATCC-3’3’-CCTAG

G-5’BamHIBclI5’-T

GATCA-3’3’-ACTAG

T-5’5’-A

GATCT-3’3’-TCTAG

A-5’BglⅡ同尾酶(Isocaudamers）同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。5’-G3’-CCTAG

GATCT-3’

A-5’BamHIBglⅡ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’BamHIBglⅡ限制性内切酶的应用：DNA重组中，供体和载体DNA的切割；DNA的序列测定；绘制限制性图谱。大肠杆菌DNA连接酶只能催化双链DNA的互补黏性末端，以NAD+为能量。T4噬菌体连接酶黏性、平末端均可连接，以ATP为能量。2.DNA连接酶1）必须是两条双链DNA。2）DNA3’端有游离的-OH，

5’端有一个磷酸基团（P）。3）需要能量

动物或噬菌体中：ATP

大肠杆菌中：NAD+2.1连接条件10～20倍。增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。1)插入片段与载体的浓度比例

2)反应温度一般14-16℃3)酶用量2.2影响连接反应的因素来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIP）来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAP）5’pOH3’DNAorRNAOH3’5’HO3.碱性磷酸单酯酶功能：催化核酸脱5`-磷酸基团，使DNA或RNA片段5`-P末端转换成5`-OH末端。5’p3’HOOH3’p5’碱性磷酸酶5OH3’HOOH3’OH5’5’p3’HOOH3’p5’碱性磷酸酶5OH3’HOOH3’OH5’活性:催化粘性末端或平端脱5`-磷酸基团4.DNA聚合酶常用的聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶KlenowfragmentT7DNA聚合酶T4DNA聚合酶修饰过的T7DNA聚合酶逆转录酶催化以DNA为模板合成DNA的一类酶。DNA聚合酶3’

5’外切酶活性5’

3’外切酶活性聚合速率持续能力大肠杆菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低无中低T4DNA聚合酶高无中低T7DNA聚合酶高无快高化学修饰T7DNA聚合酶无无快高逆转录酶无无低中TaqDNA聚合酶无有快高常用DNA聚合酶的特性比较基本性质：5’→3’的DNA聚合酶活性5’→3’的核酸外切酶活性3’→5’的核酸外切酶活性4.1E.coliDNA聚合酶Ⅰ(DNApolⅠ)大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三分之二的大肽段，即为Klenow酶；Klenow酶仍拥有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性，但失去了5’→3’的核酸外切酶活性。4.2E.coliDNA聚合酶I大片段(Klenow)基本用途补平由核酸内切酶产生的5’粘性末端DNA片段的同位素末端标记cDNA第二链的合成双脱氧末端终止法测定DNA序列5.1单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）ExoVII3’5’3’5’3’5’3’5’5.核酸酶ExoVⅢ3’5’3’5’Mg2+3’5’3’5’大肠杆菌的核酸外切酶III特异性地从3’端外切5.2双链核酸外切酶：核酸外切酶Ⅲ（ExoⅢ）lExoMg2+Ⅰ核酸外切酶特异性地从5’端外切3’5’3’5’双链核酸外切酶：Ⅰ核酸外切酶(ⅠExo)3’5’3’5’在DNA上定位RNA（S1mapping）DNAmRNA杂交S1EcoRI单链核酸内切酶：核酸酶S1内切带切口或缺口的双链DNA或RNA来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌。T4-PNP催化γ-磷酸从ATP分子转移给DNA、RNA的5’-OH末端。用于探针的末端同位素标记，使缺失5`-P末端的DNA发生磷酸化作用5’HO3’HOOH3’OH5’T4-PNPMg2+

pppATP（g-32P-ATP）5’p323’HOOH3’6.T4多核苷酸激酶p325’催化DNA片段，逐个将dNTP分子加到线性DNA分子3`-OH端，合成方向，5’→3’。不需要模板DNA，随机掺入dNTPs；给外源DNA片段及载体分子加上互补同聚物尾巴；标记DNA片段的3’末端。7.末端转移酶5’p3’HOOH3’p5’Co2+

dATP5’p3’HOAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

OH3’p5’5’p3’HOOH3’p5’Co2+

dATP5’p3’HOAAAAAAAAAAAAAAOH3’p5’AAAAAAAAAAA例：Co2+催化作用8.TaqDNA聚合酶

分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适反应温度72℃，对95℃高温具良好稳定性，该酶不存在3’→5’外切酶活性

主要用于DNA的体外扩增，一个DNA分子因而可被扩增4×106倍

DNA扩增技术又称为聚合酶链式反应

PCR的原理引物引物DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段ingThefirstthreecyclesofPCRPCR的指数扩增（2n）基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链反转录酶Mg2+dNTP3’AAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTT

oligo(dT)12-183’AAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTTT3’cDNA9.反转录酶双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链3’RNA5’

DNA3’5’3’RNA5’

DNA3’5’

5’

DNA3’基本特性

RNaseH10.RNase用于RNA的核苷酸序列分析或除去DNA样品或蛋白质合成系统中的RNA分子。RNaseA分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂（100℃加热15min仍具活性）,用于除去DNA样品中的RNA分子。如：提质粒时除RNA。11.RNaseH

作用于DNA-RNA杂交分子中的RNA链，用于cDNA文库建立时除去RNA链以便第二条链cDNA链的合成。

12.DNaseI具内切酶活性，作用于dsDNA，但无核苷酸序列特异型，当酶浓度很低时，ds-DNA分子上将形成切口用途

1)制备RNA样品时除去DNA分子

2)制备DNA探针时，在dsDNA上产生切口

3)基因突变时产生切口

Mn2+存在时

Mg2+存在时

DNaseI作用特点DNaseIHOP5’3’5’3’5’3’DNaseI与PolI的切口移位PolI二、HostsandvectorsHostorganism/cell:

wheretheplasmidsgetmultiplied增殖

andpropagated繁殖

faithfully,whichiscrucialforDNAcloning.HostsforDNAcloningvector

Prokaryotichost:E.coli(mostcases) Eukaryotichost:YeastSaccharomycescerevisiae酿酒酵母(largefragmentsofhumangenome)GeneralfeaturesofaVectorautonomouslyreplicatingDNA

independentofhost’sgenome.Easilytobeisolated

fromthehostcellMostarecircular,somearelinearContainsatleastone

selectivemarker,whichallowshostcellscontainingthevectortobeselectedamongstthosewhichdonot.Containsa

multiplecloningsite(MCS)TypesofvectorsCloningvectors

克隆载体Expressionvectors

表达载体Integrationvectors

整合载体Cloningvectors:

allowingtheexogenousDNAtobeinserted,stored,andmanipulated操作

atDNAlevel.Expressionvectors:

allowingtheexogenousDNAtobeinsertedandexpressed.PromoterandterminatorforRNAtranscriptionarerequired.bacterialexpressionvectorsyeastexpressionvectorsmammalianexpressionvectorsIntegrationvectors整合载体:

allowingtheexogenousDNAtobeinsertedandintegratedintoachromosomalDNAafteratransformation转化.Theintegrationisconductedbyhomologousrecombinationbetweenthehomologoussequencesharedbytheplasmidandthegenomeoftherecipient(受体)cells.bacterialintegrationvectors(Agrobacteriumtumefaciens根癌农杆菌

TiplasmidisusedtointegrateDNAintoplantgenome)yeastintegrationvectorsMammalianintegrationvector:virusbasedG2质粒DNA的制备质粒（plasmid）是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。常有一些对宿主有利的酶的编码基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等质粒的复制：严紧型复制（1-n个）松弛型复制（20个以上）质粒的不亲合性也称为质粒的不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。质粒的不亲合性分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。常用的质粒载体是通过DNA重组技术构建而成的。pUC18/pUC19Ampr抗性基因编码β-内酰胺酶可特异地切割Amp的β-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力pUC质粒载体的优点具有较小的分子量和更高的拷贝数;平均每个细胞500~700个拷贝。具有多克隆位点MCS区段；方便具有不同粘性末端的外源片断的插入。适用于组织化学检测重组体；具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ’基因，所编码的α-肽链可参与α-互补作用，用Xgal显色对重组子进行鉴定。外源片段插入到多克隆位点后,表达蛋白（β-半乳糖苷酶）失活,含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。质粒DNA的提取在pH12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态；将pH调至中性并有高浓度盐存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，质粒DNA仍可溶；通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。苯酚/氯仿分离蛋白质和核酸法按氯仿:异戊醇＝24:1体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。按体积/体积＝1:1混合饱和酚与氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿的各自作用酚（Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液，离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；酚和氯仿的各自作用酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收!乙醇沉淀DNA回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，是理想的沉淀剂。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。CsCl密度梯度离心琼脂糖凝胶电泳

相关知识天然琼脂（Agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose，约占80％）及琼脂胶（Agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围

核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。核酸为两性分子，在碱性环境下，碱基几乎不解离，整个分子带负电。相同碱基数量的双链DNA几乎具有等量的净负电荷，能以同样的速度向正极方向移动。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。cccDNA＞直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）＞开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。影响迁移率的因素DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所加电压（一般5V/cm）、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成等。Agrosegelelectrophoresis-veelectrode+veelectrodeNegativelychargedDNA常用染料EB:溴化乙锭（EthidiumBromide，EB），EB能插入DNA分子碱基对之间，导致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的射线，均可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出；可以加到样品中，也可加到胶中。EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。EB废液要经过处理才能丢弃。SYBR、Goldview:新型低毒，高灵敏度染料，加入样品中，价格较昂贵。图1的电泳结果不是很好，一方面上样量太大不同构象的质粒分子没有分开；另一方面有些样品RNA去除得不好，在电泳结果上可以看到大团的荧光；此外还要注意上样的技巧，上样后稍沉降一会，使样品均匀地分布于上样孔的底部再开始电泳，这样走出的条带会较均匀。图3的结果较好。AgrosegelelectrophoresisIsolationoffragmentsandAgarosegelelectrophoresisinsertRestrictiondigestionAgarosegelelectrophoresis3. GelexcisionandpurificationLigationwithvectortransformationAgroseGelElectrophoresis:琼脂糖凝胶电泳checkyourDNAateachstepSeparationandPurificationofDNAfragmentsofinterestsAnalysisofrecombinantplasmidsRestrictionanalysisofaplasmid1234562.穿梭质粒载体（shuttleplasmidvector

）是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞存活和复制的质粒载体。例：大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒载体大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体大肠杆菌-牛乳头瘤病毒！迄今还没有发展出适用的大肠杆菌-植物细胞穿梭载体3.λphage48.5kbinlengthLinearorcirculargenome(cosends)

溶菌阶段(复制和释放)溶源阶段

(整合到寄主染色体上) 5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’

CleavageLigation(duringpackaging)(afterinfection)GGGCGGGCGACCTCG-3’5’-CG+GC-5’3’-GCCCCGCCGCTGGAThephage

cosendsCircularformLinearformcoscosNonessentialregionLong(left)armshort(right)armExogenousDNA(~20-23kb)λphage12bpλ替换型载体（取代型载体）外源DNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体的感染和复制非必要的片段(约20kb)高感染效率(109

转化株/ug载体DNA,比质粒高100-倍)λ置换型载体2.组装连接3.侵染λ噬菌体包装λ噬菌体包装时，当DNA的长度短于野生型的78%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降。只包装它的野生型DNA（48.5KB）的75%~105%左右的DNA，要求λ载体和外源DNA长度之和在39～53kb之间。插入式载体可携带的外源DNA片段较替换式为小4.单链DNA噬菌体载体(M13)M13噬菌体的特点M13是一种含单链（+）DNA（ssDNA）的大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb。感染Ecoli后，在宿主细胞内会形成双链的复制型DNA（replicationformDNA,RFDNA）。可以象质粒DNA那样在体外进行纯化和操作。获得大量的单链DNA片段，主要用来DNA测序、定点突变、异源双链DNA的分析等。M13单链DNA噬菌体的生命周期RFDNAM13克隆载体分子结构图5.黏粒载体（柯斯质粒载体）cosmid载体：也称黏粒、柯斯载体。一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由λ噬菌体的cos（cohesive）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及λ噬菌体用于包装的cos末端等，因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。设计构建的柯斯质粒一般长4～6kb。cos位点可识别噬菌体的外壳蛋白。凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体λ的颗粒。因此，插入柯斯质粒的外源DNA可大于40kb。重组的柯斯质粒可象噬菌体λ一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。DigestionLigationC)PackagingandinfectFormationofacosmidcloneLigationtocleavedcosmidvectormoleculescanproducevector-targetconcatemers,resultinginalargeexogenousDNAfragmentflankedbycossequences.酵母人工染色体载体（yeastartificialchromosome,YAC）细菌人工染色体（bacterialartificialchromosome,BAC）动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒）人基因组十分庞大，约含4×109bp，建立和筛选人的基因组文库，要求有容量更大的载体。酵母人工染色体（yeastartificialchromosome,YAC）载体应运而生。YAC含有酵母染色体端粒（telesome）、着丝点(centromere)及复制起点等功能序列，可插入长度达200-500kb的外源DNA6.酵母人工染色体酵母人工染色体含有：*四膜虫端粒（tel)*酵母自主复制序列（ARS)*酵母着丝点(CEN)*酵母的选择标记(TRP1、URA1)YAC载体7.BAC载体三、RecombinantDNATechnology

DNA重组技术IsolationoftargetgeneSelectionandconstructionofvectorsLigationoftargetDNAandvectorTransformationoftargetgeneintoreceptorcellScreeningforrecombinantplasmidsExpressingaclonedgene

Processofcloning基因克隆研究程序

ProcessofDNAcloning

1.IsolationoftargetgeneChemicalsynthesis：onlyforsimplepolypeptidechainwhoseprimarystructureisclear.ObtainingfromgenomicDNAlibraryObtainingfromcDNAlibrarypolymerasechainreaction(PCR)

Afewcommonlyusedvectors：plasmidphagecosmidyeastartificialchromosome(YAC)2.Selectionandconstructionofvectors质粒载体噬菌体载体柯斯质粒载体真核细胞克隆载体

LigationoftargetDNAandvectors1.Ligationofstickyend

2.Ligationofbluntends3.Theadditionofahomopolymertail

AddingasequenceofDNAfragment,whichcontainsthecleavagesiteforrestrictionendonuclease.

4.ArtificiallinkerArtificiallinker

In