度烧伤创面原位再生修复过程中不同活组织k19的表达

度烧伤创面原位再生修复过程中不同活组织k19的表达

1皮肤损伤的治疗本组病例为我院2001年7月至2002年12月住院患者，其中8名男性和2名女性，年龄最低，最高年龄为39岁，平均年龄为27岁，烧伤总面积（52.2.34.64）%，i级烧伤（9.6.69）%。级烧伤的所有伤口均通过病理切割后，所有伤口均为皮肤层坏死。重点是四肢上的损伤伤口，包括5只上肢和5张下肢。全身治疗方法同常规治疗。局部治疗:10例患者入院后常规行湿性医疗技术加外用重组人表皮生长因子衍生物(rhEGF)治疗。在获得了患者及其家属的知情同意后,在距Ⅲ度烧伤创面边缘约4cm处用手术尖刀分别切取伤后3～6d的痂下活组织、伤后25～32d的肉芽样组织、早期再生组织(创面刚愈合时)以及晚期再生组织(创面愈合后1年),每次切取的组织块大小约1.0cm×0.5cm×0.8cm,行常规病理学检查以及免疫组织化学染色检查。另外,选择既往我院手术治疗的6例外院诊治3个月以上未愈的慢性皮肤溃疡标本做对照,取2例整形患者供皮区的正常皮肤组织作阳性对照。1样品处理和检测细胞表达小鼠抗人K19型单克隆抗体和过氧化酶标记的链霉卵白素(SP)试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。重组人表皮生长因子衍生物(rhEGF,2000IU/ml,商品名:金因肽)购自深圳华生元基因工程发展有限公司。美宝湿润烧伤膏(MEBO)购自北京光明中医烧伤创疡研究所汕头美宝制药厂。恒冷冰冻切片机(LeicaCM1800,德国)。华利生物组织自动脱水机(江苏)。华利自动包埋机(江苏)。轮转切片机(ZEISS,德国)。恒字电热恒温培养箱(上海)。显微照相系统(ZEISS,德国)。所有标本经石蜡包埋,系列切片,厚度为5μm。将切片随机分成两组,分别用于常规病理学检查(HE染色)和免疫组织化学染色检查。石蜡切片常规脱蜡至水后,用苏木精-伊红染色法染色,光镜下观察。应用过氧化酶标记的链霉卵白素(SP)免疫组化法,以小鼠抗人K19型的单克隆抗体来检测K19表达阳性细胞。实验操作按试剂盒说明书进行。石蜡切片常规脱蜡至水,3%H2O237℃孵育10min,以消除内源性过氧化物酶活性。PBS漂洗后置于0.01mol/L,PH6.0的枸橼酸盐缓冲液中行抗原热修复,5%正常山羊血清封闭后加入一抗,4℃过夜。PBS冲洗,滴加生物素标记的二抗37℃孵育15min,PBS漂洗,滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素,37℃孵育15min后DAB(二氨基联苯胺)显色,苏木精复染,常规脱水、透明、封片,显微镜下观察。细胞胞浆染成棕黄色为阳性细胞,同时设不加一抗的阴性对照。2早期再生组织病理学检测10例患者的Ⅲ度烧伤创面上的脂肪组织逐渐被肉芽样组织代替,伤后25～32d的肉芽样组织中开始长出皮丁,以后皮丁逐步形成皮岛,最后融合成片直至痊愈,愈合时间为(39.2±7.3)d。愈后不久,再生组织逐渐出现疤痕增生,经抗疤痕防治1年后再生组织逐渐变成平软而富有弹性的组织。痂下正常活组织常规病理学检查为脂肪纤维组织,部分变性坏死,大量中性白细胞.淋巴细胞浸润;肉芽样组织常规病理学检查为炎性肉芽组织;早期再生组织常规病理学检查示表皮层较正常皮肤的表皮层明显增厚,表皮脚发达;晚期再生组织常规病理学检查示正常皮肤;慢性皮肤溃疡组织常规病理学检查示慢性皮肤溃疡。正常皮肤只有表皮基底层和附属器部分细胞表达K19。伤后3～6d,10例患者的痂下活组织均未发现K19表达阳性细胞。肉芽样组织有部分细胞表达K19;早期再生组织检测结果示:在再生表皮的中部,即位于基底膜与颗粒层之间有大量的K19表达阳性细胞,且分布广泛而有规律;晚期再生组织检测结果显示:与正常皮肤类似。6例外院诊治的慢性皮肤溃疡标本均未发现K19表达阳性细胞。3表皮胞技术的应用角蛋白(keratin)是一种直径为10nm左右的纤维状蛋白,是上皮细胞的结构蛋白和主要蛋白,在细胞内形成广泛的网状结构。角蛋白作为表皮或上皮细胞特有的一类蛋白,在机体内至少有20种不同类型,随着细胞分化的进程,可以检出它们逐渐表达不同的角蛋白,如有丝分裂后分化细胞表达K1、K10,短暂扩充细胞表达K5、K14,表皮干细胞表达K19,其中,K19的分子量为40kDa,是角蛋白家族中最小的成员,在皮肤中的表达随年龄的增加而减少。自从1995年MichelM等采用双标记方法证明毛囊里的K19表达阳性细胞正是[3H]胸腺嘧啶核苷标记滞留细胞以来,K19单克隆抗体就被广泛用于检测表皮干细胞。应用过氧化酶标记的链霉卵白素(SP)免疫组化法,以小鼠抗人K19型的单克隆抗体来检测角蛋白19在Ⅲ度烧伤创面修复过程中的表达特征时,作者发现:⑴Ⅲ度烧伤创面经湿性医疗技术加外用重组人表皮生长因子衍生物(rhEGF)治疗后角蛋白19阳性细胞可以从无到有产生并不断增加,以实现Ⅲ度烧伤创面原位再生修复,结合相关文献,作者认为这些K19表达阳性细胞就是表皮干细胞;相反,既往本院手术治疗的6例外院诊治3个月以上未愈的慢性皮肤溃疡标本均未发现K19表达阳性细胞,进一步证明了表皮干细胞是创面原位再生修复的必要条件。⑵在再生表皮的中部,即位于基底膜与颗粒层之间有大量的K19表达阳性细胞,且分布广泛而有规律。JohesPH体外培养实验表明:在没有真皮存在时,表皮干细胞也能形成类似体内的空间结构。由此推测表皮干细胞先是克隆性生长,达到一定数量后再从最表层开始逐渐分化成熟为其它功能细胞。⑶大量研究表明:细胞是生物形态结构和功能活动的基本单位,细胞间的相互作用是决定细胞命运的重要因素之一。李毅等的实验研究就是证据之一。因此,作者认为,在皮肤创伤修复过程中可能存在优势假说,即皮肤创伤修复是一个系统工程,许多相关细胞分泌大量的相关细胞因子,通过复杂的生物信息,直接或间接地对基因进行调控,并象网络一样相互影响。在皮肤创伤修复过程中,当创面微环境有利于表皮生长且表皮的生长占优势时,创面愈合就朝生理性愈合方向发展,最终,缺损组织完全再生;相反,当创面微环境不利于表皮的生长或表皮的生长处于劣势时,创面愈合就朝病理性愈合方向发展,最终,缺损组织不完全再生。由于早期重建有利于表皮干细胞增殖分化的生理环境,虽然治疗早期表皮的生长相对处于劣势,实际上,表皮的生长仍相当活跃。本文结果表明,肉芽样组织中的确有K19表达阳性细胞,至创面愈合早期,再生表皮的中部,即位于基底膜与颗粒层之间有大量的K19表达阳性细胞。鉴于此,作者采用了皮肤针药物导入加弹力压迫等综合治疗,有效抑制疤痕的过度增生,表皮的生长就由劣势转为优势,最后,疤痕逐渐变成平软而富有弹性的组织。近年来,成体干细胞的研究获得了许多进展。到目前为止,不仅在骨髓、血液、神经、皮肤和肝脏等许多组织中发现了成体干细胞,而且在肉芽组织中发现了可以分化成脂肪、软骨、骨的成体干细胞-间充质干细胞。最近,ZukPA等人在人类脂肪组织中成功分离和鉴定了类似间充质干细胞的多能干细胞。同时,各种各样的动物相继克隆成功,也初步显示已分化成熟的有核细胞仍具有全能性。这些研究提示了Ⅲ度烧伤创面很有可能获得原位再生修复,但有关K19在人体Ⅲ度烧伤创面原位再生修复过程中不同时期的表达特征以及K19与原位再生修复的关系等尚未见详细报道。本文应用过氧化酶标记的链霉卵白素SP)免疫组化法,以小鼠抗人K19型单克隆抗体检测Ⅲ度烧伤创面原位再生修复的不同时期、不同组织K19表达的特征;另外,选择既往我院手术治疗的6例外院诊治3个月以上未愈的慢性