普洱茶不同组分对icr肥胖小鼠降脂减肥作用研究

普洱茶不同组分对icr肥胖小鼠降脂减肥作用研究

胖是遗传因素和环境因素相互作用的营养代谢障碍，主要表现为身体能量摄入过多的能量平衡。这是慢性疾病的主要原因，它可能导致与心脏疾病有关的各种代谢功能异常，如糖尿病、冠状动脉粥样硬化、心理压力、高血压、异常脂质血症、睡眠时呼吸停止、双重癌（如菊潮、胸腺癌和癌）的发病率和死亡率。现代人生活节奏的加快和膳食结构的改变导致许多国家肥胖症的发病率和死亡率也随之不断升高,预防和治疗肥胖症已经成为21世纪的首要公共安全卫生问题。普洱茶是以原产普洱府辖地,并以普洱(现普洱市宁洱县)这一集散地而得名的具有独特外形和内质的传统历史名茶。如今它已成为东南亚各国、港澳台地区及欧美国家茶叶市场上倍受消费者推崇的特种茶。尤其是它具有降低血脂、减肥、抑菌、助消化、解毒等多种功效,在日本、法国、德国、意大利、香港、澳门等国家和地区更是深受青睐。关于普洱茶的降脂减肥作用,最早研究是日本学者MitsuakiSano,他在1985年的试验证明给高脂大鼠饲喂普洱茶,可以降低高脂大鼠血浆内的胆固醇和甘油三酯含量,显著降低高脂大鼠腹部脂肪组织重量。T.T.Yang等的研究认为高胆固醇造模后的大鼠在饲喂普洱茶后,食物和饮水消耗减少,体质量下降,血浆和肝脏中的胆固醇和甘油三酯含量下降,高密度脂蛋白胆固醇含量增加。Kuo等的试验结果也表明正常大鼠喂食普洱茶30周后,体质量、胆固醇和甘油三酯含量均显著降低,且降低幅度大于绿茶、乌龙茶和红茶处理,同时低密度脂蛋白胆固醇降低,而高密度脂蛋白则显著升高,抗氧化物歧化酶SOD活性较正常对照组要高。这些研究主要是侧重于普洱茶的整体减肥效果,对普洱茶不同组分的降脂减肥效果研究较少,本文旨在比较普洱茶不同提取成分的降脂减肥作用,找出普洱茶中起降脂减肥作用的主要功能成分,为普洱茶深加工产品的开发,降脂减肥药物的研究提供一定的理论依据。1材料和方法1.1蛋白试剂及检测试剂2003年普洱熟茶:由普洱市茶树良种场(云南,普洱)提供;左旋肉碱:市售“露卡素”牌左旋肉碱。血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)及脂质过氧化产物丙二醛(MDA)、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所,其他试剂均为国产分析纯。1.2冻离心测定HP8453紫外-可见分光光度计,BECKMANJ2-HS超高速冷冻离心机,ThermoMultiskanSpectrum酶标仪,BuchiREM旋转蒸发仪,CHRISTALPHR1-4LDplus真空冷冻干燥仪,DY89-Ⅱ型电动玻璃匀浆机,医用解剖器械等。1.3实验方法1.3.1实验动物中心清洁级,雄性ICR小鼠,75只,体质量(20±2)g,购自浙江大学实验动物中心。实验动物生产许可证号:SCXK(浙)2009-0029,实验动物使用许可证号:SYXK(浙)2009-0132。小鼠基础饲料(M02-F)和高脂饲料(M04-F)购于上海斯莱克公司。1.3.2各分分离组成的准备1.3.3实验分组和给药实验前,供试ICR小鼠在清洁屏障环境下适应性喂养1周,按体质量随机分为2组,其中空白对照组(controlgroup,CG)10只,喂饲基础饲料;其余65只为造模组(modal-creationgroup,MCG),喂饲高脂饲料,每周称量一次小鼠体质量。造模成功后(40d)取其中60只小鼠按体质量随机分成6组,每组10只,分别为肥胖模型对照组(obesitymodelgroup,OMG)、左旋肉碱组(L-carnitinegroup,LCG)、普洱茶总水提物组(pu-erhteaaqueousextractgroup,PAG)、乙酸乙酯组(ethylacetategroup,EAG)、正丁醇组(n-butylalcoholgroup,BAG)和剩余水层组(surplusaqueousextractgroup,SAG),喂食高脂饲料。各实验组均按体质量灌胃相应剂量(1.5mg/kg)的对应萃取物,空白对照和高脂模型组灌胃蒸馏水。实验周期为8周,实验期间大鼠自由饮水和取食,隔天称1次体质量,记录摄食量。实验结束时禁食12h,处死小鼠快速收集血液,解剖小鼠,快速分离小鼠肝脏及体脂(睾丸及肾周脂肪垫)并称重,检测血液和肝脏的生化指标。1.3.4脂肪及硬化指数ade的计算各指标均采用试剂盒方法测定。食物利用率(体质量增加量/摄食量×100%)、脂肪系数[(肾周脂肪+睾丸周脂肪)/动物体质量×100%],以及致动脉粥样硬化指数[atherosclerosisindex,AI=(TC-HDL-C)/HDL-C]按相应的公式计算。1.3.5b统计分析实验数据采用Origin8.0软件进行数据处理和方差分析,以平均值±标准差(xuf0b1s)表示。采用单因素方差分析,与对照组相比,*表示P<0.05,为差异显著,**表示P<0.01,为差异极显著。2室环境控制实验全过程均在小动物屏障实验室进行,实验室环境控制良好,温湿度均处于正常的范围。各实验组小鼠未发现明显异常,饮食、活动状况良好,粪便呈黑褐色长颗粒状,尿液正常。2.1剩余水层的主要物质为测定无水乙醇沉淀。据见表1,2常规检测方法测定普洱茶氯仿层中主要是咖啡碱,含量达干物质的82.3%,普洱茶乙酸乙酯萃取层和正丁醇萃取层的茶多酚含量分别为54.7%和33.5%,剩余水层主要物质为茶褐素、多糖类,还有部分蛋白质、多酚类等,蛋白质和多糖类经无水乙醇沉淀出来后测得剩余水层的茶褐素含量约为干物质含量的38.4%。HPLC检测结果表明普洱茶乙酸乙酯萃取层中儿茶素类和没食子酸含量分别为16.4%和2.8%,正丁醇萃取层分别为3.3%和0.6%,在乙酸乙酯萃取层和正丁醇萃取层都没有发现茶黄素,推测可能是因为普洱茶经过后发酵后在长期的储藏过程中茶黄素氧化聚合成茶红素、茶褐素及一些高分子的化合物。2.2两组相对于空白组内镜造模的实验结果(表1)表明,造模结束后,造模组(MCG)大鼠体质量增加明显,相对于空白组(CG)有极显著差异(P<0.01)。在总摄食量方面,造模组的小鼠总摄食量有显著下降,但食物利用率相对于空白对照则大幅度提高(利用率分别为8.48%和12.81%),说明高脂饲料对促进小鼠营养型肥胖有显著性作用,实验造模结果是成功的。2.3不同减肥药对小鼠体质量的影响从图2可以看出,空白对照组和肥胖模型组小鼠体质量的变化比较有规律地接近线性关系,而5个实验处理组小鼠体质量在实验初期都有明显的下降趋势,这可能与小鼠对新物质的适应有关,还有可能受灌胃的影响。实验中期小鼠体质量逐渐上升并恢复到实验初的水平,实验末期各处理组小鼠体质量又逐渐下降,其中以乙酸乙酯组和剩余水层组下降最为明显,虽然与肥胖模型组相比还没达到显著性差异,但小鼠体质量值已下降到接近空白对照组的水平。各实验处理组小鼠始末体质量差值与肥胖模型组和空白对照组均有极显著差异(P<0.01)(表2),其中乙酸乙酯组和剩余水层组小鼠体质量增加值仅为0.6g和0.4g,几乎保持恒定的体质量。本实验的结果说明实验的ICR小鼠在摄食高脂饲料时,如果同时灌胃一定剂量的减肥药左旋肉碱或者普洱茶提取物有助于抑制高脂饲料对小鼠体质量增加的效果,从而起到减肥作用。另一方面,总的摄食量和食物利用率也是影响小鼠体质量变化的关键因素,在本实验中(表2),除去部分组小鼠有撒食现象影响外,各组小鼠在实验期间摄食量均无显著性差异,但不同实验处理组小鼠对食物的利用率有变化,肥胖模型组食物利用率最高(3.61%),小鼠体质量增重较明显;除去空白对照组(2.16%)、减肥药左旋肉碱组(1.18%)外,普洱茶总水提物组、乙酸乙酯组、正丁醇组和剩余水层组食物利用率则相对较低,均没有超过1%。说明高脂食物对小鼠体质量增加的作用没体现出来,其原因可能是减肥药左旋肉碱或普洱茶组分能抑制小鼠对高脂饲料的转化或吸收,从而体现出降脂减肥的作用,另一方面也说明各组大鼠体质量的减轻不是通过减少对食物的摄取来达到目的的。2.4降脂饲料对小鼠脂肪堆积的影响实验结束后,肥胖模型组小鼠肾周脂肪垫和睾丸周脂肪垫重量均明显高于空白对照组,表明高脂饲料能有效促进脂肪的堆积,其总脂肪重与空白对照组有极显著差异(P<0.01)(图3)。实验组中左旋肉碱组、乙酸乙酯组、普洱茶水提取物组以及剩余水层组小鼠体内脂肪垫重量都呈现极显著差异(P<0.01),尤其是减肥药左旋肉碱组,其小鼠体内脂肪垫重量趋近与空白对照组。实验结果表明普洱茶各组分均能有效抑制喂食高脂饲料肥胖小鼠体内脂肪堆积,其作用效果稍差于减肥药左旋肉碱,其中以剩余水层组和乙酸乙酯组小鼠体内脂肪垫重量下降较为明显,说明普洱茶对单纯营养型肥胖小鼠有显著抑制体内脂肪堆积的减肥效果。另一方面,脂肪系数是小鼠体内脂肪垫总重量与小鼠体质量的比值,它也是判定小鼠的肥胖程度的重要指标,从图3的数据可以看出,在降低小鼠脂肪系数方面,减肥药左旋肉碱体现出了最好的效果,其值基本接近空白对照组的脂肪系数值。这可能与其本身的性质有关,左旋肉碱(L-Carnitine)是一种能促使脂肪转化为能量的类氨基酸,是脂肪代谢过程中脂肪酸β-氧化的关键物质,它的基本功能是作为载体把脂肪酸从线粒体外运入线粒体内膜中体氧化分解,从而除去机体内多余的脂肪及其他脂肪酸的残留物,使细胞内的能量得到平衡。它能够通过减少C57BL/6小鼠体内脂肪的累积进而对肥胖症以及其并发症(心血管疾病或不含酒精的脂肪肝)的治疗起到辅助作用。同时,普洱茶各组分对降低肥胖小鼠的脂肪系数也有较好的效果,与肥胖模型组达到了显著性差异(P<0.05),虽然与空白对照组相比也存在较为明显的差异,但已经很好抑制了小鼠脂肪系数的进一步增加,有效的地改善了小鼠的综合指标。2.5对施肥药和茶树酯对小鼠血清生化指标的影响肥胖症与体内血清、肝脏的血脂水平密切相关,体内血脂的升高可能是产生肥胖症的前兆。本实验的结果(表3)表明:与空白对照组相比,肥胖模型组大鼠血清和肝脏的TC、TG均有明显增加,达到了极显著差异(P<0.01);而血清中HDL-C指标则有所下降,体现出显著性差异(P<0.05)。说明高脂饲料有明显促进小鼠体内血脂水平上升的效果。经过减肥药和普洱茶不同组分灌胃处理后,在小鼠血清中,除普洱茶正丁醇组外,其他组TC、TG均有明显下降,其中乙酸乙酯组和剩余水层组对TC作用最明显,普洱茶总水提物对TG降低效果最为显著,乙酸乙酯组和剩余水层组其次,它们(包括左旋肉碱组)的TG水平不仅显著低于肥胖模型组,而且与空白对照组相比也达到了极显著水平(表3),表明减肥药和普洱茶各组分(除正丁醇组)对降低肥胖小鼠体内血清TG含量有显著的效果。而在提高小鼠血清HDL-C水平方面,在各实验处理组中,只有乙酸乙酯组和剩余水层组体现出显著的效果,普洱茶总水提物有一定的作用。减肥药左旋肉碱组和正丁醇组则基本没什么影响。综合来看,减肥药左旋肉碱和普洱茶各组分(除正丁醇组)对肥胖小鼠体内血清指标均有一定的改善作用,对TG和HDL-C的改善效果要优于TC。在肝脏脂质水平方面,与血清的结果有一定的区别,首先,在降低TC方面,各实验组(除正丁醇组)小鼠血清TC值均高于空白对照组,TG则都低于空白对照组;而在肝脏中正好相反,肥胖小鼠肝脏TC值均低于空白对照组,TG则高于空白对照组。尤其是减肥药左旋肉碱组,在血清指标中,其降低TG的效果在各实验组中最差,而对肝脏TG的降低效果则是最好的,这可能与左旋肉碱具有运载酶的特性有关系。在对肥胖小鼠血清致动脉粥样硬化指数(AI)的影响方面,肥胖模型组小鼠的AI值明显高出空白对照组10多倍,表明喂食高脂饲料会显著增加小鼠患动脉粥样硬化等疾病的几率。而经过实验处理后,各实验组小鼠的致动脉粥样硬化指数值明显降低,尤其是乙酸乙酯组和剩余水层组的AI值已降低至接近空白对照组的水平,表明普洱茶某些组分在抗动脉粥样硬化方面有很大的潜力。2.6大鼠肝脏抗氧化活性图4的结果表明,普洱茶各组分能明显提高大鼠血清、肝脏中SOD和GSH-PX活性,降低脂质过氧化产物MDA的含量。与肥胖模型组比较,普洱茶总水提物、乙酸乙酯层萃取物以及剩余水层能极显著提高大鼠血清及肝脏的SOD、GSH-PX活性,极显著降低MDA的含量;正丁醇萃取物在各个指标上均没有体现出相应的活性;减肥药物左乙酸乙酯层萃取物以及剩余水层能极显著提高大鼠血清及肝脏的SOD、GSH-PX活性,左旋肉碱对提高小鼠肝脏GSH-PX活性、降低肝脏MDA含量方面体现出了极显著的效果(P<0.01),对提高肥胖小鼠血清SOD活性、降低MDA含量有一定的效果,在其他指标上则没表现出明显的活性。2.7显微镜相同视野范围内脂肪细胞数量减少的原因普洱茶不同组分茶对肥胖小鼠脂肪细胞的影响如图5所示,结果表明,肥胖模型组小鼠脂肪细胞变大,脂肪细胞大小不均且有一定的变形,显微镜相同视野范围内脂肪细胞数量减少。与肥胖模型组小鼠比较,普洱茶总水提物组、乙酸乙酯组和剩余水层组小鼠脂肪细胞直径明显减小,同一视野范围内的脂肪细胞数量增加,并且乙酸乙酯组与剩余水层组小鼠脂肪细胞大小已接近于空白对照组,揭示了普洱茶含有的能减少脂肪细胞脂肪的积累,抑制脂肪细胞膨大的有效功能成分可能存在于乙酸乙酯萃取物或(和)剩余水层中。3茶树提取物的指标检测本实验利用丙酮、水、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇连续萃取普洱茶,得到不同的组分进行普洱茶降脂减肥作用研究,并与商品减肥药左旋肉碱进行对比,得到以下结论。(1)普洱茶不同溶剂的提取组分均对