固相萃取结合超高效液相色谱-串联质谱法测定冻干鱼粉中恩诺沙星和环丙沙星残留量

固相萃取结合超高效液相色谱-串联质谱法测定冻干鱼粉中恩诺沙星和环丙沙星残留量

恩诺沙星和环丙沙星属于赫诺酮类药物（quinolos，qns）。由于其强抗菌性、抗菌谱广、效率高、低毒、组织渗透性和低价格，已成为医学诊断和水产养殖中的一种重要抗感染药物。但是,动物用药后的药物残留可以通过食物链传递,会引起人体不良反应,影响人体健康。因此,对动物体内喹诺酮类药物残留量的检测已越来越受到人们的关注。目前常见的喹诺酮残留检测方法主要有酶联免疫法、高效毛细管电泳法、液相色谱法和液相色谱-串联质谱法[9,10,11,12,13,14]。本实验采用固相萃取和液液萃取两种方法对样品进行前处理,以超高效液相色谱-串联质谱测定,比较了两种前处理方法的测定结果和优缺点,为水产品及其制品中恩诺沙星和环丙沙星残留检测提供参考。1材料和方法1.1主要试剂与仪器鲤鱼鲜鱼2000g,放血、去鳞、去内脏、去皮,取背部肌肉搅碎;冻干鲤鱼粉威海出入境检验检疫局。乙腈、甲醇、正己烷、甲酸(均为色谱纯)美国Fisher公司;柠檬酸、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸二钠(均为分析纯)国药集团化学试剂公司;环丙沙星(纯度94.0%)、恩诺沙星(纯度99.0%)德国DrEhrenstofer公司;水为Milli-Q超纯水;OasisHLB6mL/200mg固相萃取小柱美国Waters公司。ORAcQuityTM-TQD超高效液相色谱-串联质谱仪美国Waters公司;MTN-2800氮吹仪天津奥特赛恩斯公司;R-210旋转蒸发仪Buchi公司;KQ5200B型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司;Allegra64R离心机BeckmanCoulter公司;CP224S电子分析天平Sartorius公司。1.2缓冲溶液配制分别准确称取适量恩诺沙星和环丙沙星标准品,用乙腈溶液配制成0.2mg/mL的标准储备液,-18℃避光保存。Mcllvaine缓冲溶液:将1000mL0.1mol/L柠檬酸溶液与625mL0.2mol/L磷酸氢二钠溶液混合,必要时用盐酸或氢氧化钠调节pH值至4.00±0.05;EDTA-Mcllvaine缓冲溶液:称取60.5g乙二胺四乙酸二钠放入1625mLMcllvaine缓冲溶液中,振摇使其溶解。1.3试验条件1.3.1流动相lma色谱柱:WatersACQUITYUPLCBEHC18柱(50mm×2.1mm,1.7μm);流速:0.2mL/min;柱温:35℃;进样体积:10μL。流动相:A为甲醇-乙腈溶液40:60(V/V),B为体积分数为0.2%甲酸溶液;梯度洗脱条件见表1。OR1.3.2离子源温度u电离模式:电喷雾电离正离子模式(ESI+);检测方式:多反应监测(MRM);毛细管电压:1.2kV;透镜电压:0.1V;离子源温度:120℃;脱溶剂气温度:350℃;脱溶剂气流量:650L/h。定性离子对、定量离子对、锥孔电压及碰撞能量见表2。1.4固相萃取法1.4.1超声提取法称取试样0.5g(精确至0.1mg),置于50mL聚四氟乙烯离心管中,加入2.5g水,摇匀,静置10min,然后加入20mL0.1mol/LEDTA-Mcllvaine缓冲溶液,用均质器均质1min,超声提取10min,5℃条件下10000r/min离心5min。1.4.2淋洗脱液和洗脱液的制备分别用6mL甲醇洗涤、6mL水活化HLB固相萃取柱,取4mL提取液以2～3mL/min的速度过柱,弃去滤液,用2mL5%甲醇溶液淋洗,弃去淋洗液,将小柱抽干,再用6mL甲醇洗脱并收集洗脱液。洗脱液用氮气吹干后,用1mL乙腈-体积分数0.2%甲酸溶液(体积比1:9)溶解,涡旋混合1min,0.22μm滤膜过滤,待超高效液相色谱-串联质谱仪测定。1.4.3标准溶液的配制移取一定体积的标准储备液,用初始流动相稀释成1.0μg/mL质量浓度的混合标准溶液。取阴性样品5份,依次加入一定量的混合标准溶液,按照以上方法处理,得到质量浓度分别为2、5、10、30、60ng/mL的系列标准溶液。1.5萃取液的方法1.5.1氟乙烯离心管的制备称取试样0.5g(精确至0.1mg),置于50mL聚四氟乙烯离心管中,加入2.5g水,摇匀,静置10min,然后加入20mL2%的甲酸-乙腈溶液,用均质器均质1min,超声提取10min,4000r/min离心5min。1.5.2鸡心瓶和鸡心瓶蒸发将上清液转移到预先加有25mL乙腈饱和的正己烷的分液漏斗中,充分振荡、静止分层,弃去上层溶液,将下层溶液取4mL转移至50mL鸡心瓶中,于40℃水浴中旋转蒸发干。用1mL乙腈-体积分数0.2%甲酸溶液(体积比1:9)溶解,涡旋混合1min,0.22μm滤膜过滤后,待超高效液相色谱-串联质谱仪测定。1.5.3标准溶液的配制移取一定体积的标准储备液,用初始流动相稀释成质量浓度1.0μg/mL的混合标准溶液,将混合标准溶液稀释成质量浓度为0.5、1、10、30、60ng/mL的标准溶液。2结果与分析2.1不同浓度提取液对提取效果的影响恩诺沙星和环丙沙星在多数溶剂(包括水)中溶解性较差,而易溶于含水相(质子化或酸解离)的酸性溶液,因此两种提取方法中的提取液均为酸性溶液。实验发现,固相萃取法中用缓冲液提取时容易乳化,造成离心不完全,上柱时柱子容易堵塞。比较用4、l0、20mL提取液上柱浓缩,发现4mL提取液上柱,处理时间短,且回收率理想,最终确定用4mL提取液进行过柱。液液萃取法中用组织渗透力强的乙腈并在其中添加2%甲酸作为提取溶剂进行提取实验,结果表明,该提取试剂不仅除蛋白的效果好,而且容易浓缩。然而将20mL提取液全部用来浓缩,回收率仅50%,且杂质干扰严重。实验比较了用4、l0、20mL提取液进行浓缩,发现4mL提取液浓缩效果最佳,回收率均大于70%,最终确定用4mL提取液进行浓缩。2.2流动相及ph值对色谱灵敏度的影响环丙沙星、恩诺沙星结构式中含有羧基和哌嗪基,属于酸碱两性化合物,因而流动相的pH值可能会对灵敏度造成一定的影响,在流动相中加入甲酸,可以有效改善峰形,增加其离子化效率。实验证明,0.2%的甲酸-乙腈溶液比0.1%的甲酸-乙腈作流动相检测灵敏度高,且峰形较佳。然而当pH值过低时,会对色谱系统的寿命有影响。故本研究以0.2%的甲酸-乙腈溶液为流动相,采用梯度洗脱的方法,可获得较好的实验结果(图1)。2.3检出限和定量限分别以恩诺沙星和环丙沙星的响应面积为纵坐标、以质量浓度为横坐标,进行线性回归,以3倍信噪比计算检出限(LOD),以10倍信噪比计算定量限(LOQ)。线性方程、检出限和定量限见表3。固相萃取和液液萃取检出限分别为1.0μg/kg和0.1～0.2μg/kg。2.4添加回收试验以阴性鲤鱼背部肌肉为代表,按照上述两种处理方法分别进行样品分别添加4、10、20μg/kg3个水平的添加回收试验,每个水平下做6次平行实验,结果见表4。从表4可以看出,固相萃取和液液萃取方法的回收率分别为95%～112%和75%～90%,相对标准偏差分别为2.9%～7.4%和1.0%～4.6%。2.5样品的测定和分析实验发现冻干鲤鱼粉样品不加水提取所得结果只有加水润湿提取的20%～30%,因此鱼粉在提取前须先用适量的水润湿(特别是采用酸化乙腈提取时),否则提取不完全。为验证方法的实用性和准确性,利用本实验建立的方法对冻干鲤鱼粉中可能存在的恩诺沙星和环丙沙星残留进行定性和定量分析,参加完成了2009年CNAST0458水产品中恩诺沙星、环丙沙星检测能力验证计划,测定结果见表5。结果表明,两种前处理方法用添加回收校正结果Z值均小于2,结果均较为满意。2.6固相萃取柱净化以上方法学考察、样品测定结果表明,固相萃取法中用EDTA-Mcllvaine缓冲溶液作为提取液,HLB固相萃取柱净化样品,所需的溶剂消耗量少,同时采用阴性样品基质加标法,可以有效的排除基质干扰,回收率高,但检出限是液液萃取法的5～10倍,且HLB固相萃取柱价格昂贵,检测成本较高。液液萃取法是一种常用的前处理方法,它对实验条件和仪器要求不高、成本低、方法检出限低,但需要消耗大量的有机溶剂,耗费时间长,回收率稍低。3两种提取方法对于提取效率的影响本实验采用超高效液相色谱-串联质谱法测定冻干鲤鱼粉中恩诺沙星和环丙沙星残留,通过对固相萃