高效液相色谱法同时测定卷柏和垫状卷柏中2种炔多酚和双黄酮

高效液相色谱法同时测定卷柏和垫状卷柏中2种炔多酚和双黄酮

柏树是柏树科植物的柏树。蒲公英（托吡鲁姆，ethy）s.pullingata（托吡鲁姆，ethyv.）maxim。干燥的全草，具有活血和生理性疼痛的功效。2010年版《中国药典》收载了以穗花杉双黄酮为质控指标的含量测定方法。作者前期对卷柏和垫状卷柏进行了系统的化学研究,发现二者均富含不同连接方式的双黄酮类化合物。现代药理研究表明卷柏药材中的双黄酮类成分具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、舒张血管等活性,且双黄酮的连接方式与活性密切相关;而selaginellin类成分具有抗微生物、抗氧化、抗衰老及神经保护作用。因此,这2类成分同为卷柏药材的特征性成分和活性成分。本文采用HPLC-DAD,同时测定不同产地的10批卷柏和12批垫状卷柏中selaginellin,selaginellinB,穗花杉双黄酮,穗花杉双黄酮-7-甲醚,扁柏双黄酮,异柳杉双黄酮6种成分的含量,旨在为全面评价卷柏药材的质量提供科学依据。1实验药材和试剂HP1100高效液相色谱系统(自动进样器,二元泵,柱温箱,DAD检测器,AgilentTechnologiesInc.USA);KH3200E超声波清洗仪(昆山禾创超声仪器有限公司);BP211D电子天平(SatoriusCo.Ltd.,德国)。本实验所用的各批次药材均购于中国各地的药材市场,药材公司或自采,经中国药科大学王强教授鉴定,分别为卷柏S.tamariscina和垫状卷柏S.pulvinata。乙腈为色谱纯(ROE,ROEScientificInc,USA);水为乐百氏纯净水;其他试剂均为分析纯,购自南京化学试剂厂。Selaginellin,selaginellinB,穗花杉双黄酮,穗花杉双黄酮-7-甲醚,扁柏双黄酮,异柳杉双黄酮对照品为作者自制,经1H,13C-NMR及ESI-MS确定结构,HPLC-UV面积归一化法计算纯度均在98%以上。2方法和结果2.1检测波长和条件色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),ZORBAXC18预柱(4.6mm×12.5mm,5μm)。检测波长280,337nm;流速1mL·min-1;柱温30℃;进样体积10μL。流动相乙腈(A)-0.1%甲酸水(B),梯度洗脱,0～10min,36%A;10～28min,36%～50%A;28～29min,50%～58%A;29～35min,58%A;35～45min,58%～85%A。卷柏药材及对照品色谱图见图1。2.2药渣的提取药材粉碎,过40目筛。精密称取干燥至恒重的样品细粉2g,置500mL锥形瓶中,加400mL75%乙醇回流提取1h,滤去药渣,溶液浓缩至干。加甲醇定容至10mL,过0.45μL微孔滤膜,即得供试品溶液。2.3对照品溶液的制备分别精密称取selaginellin,穗花杉双黄酮,selaginellinB,穗花杉双黄酮-7-甲醚,扁柏双黄酮,异柳杉双黄酮适量,用甲醇溶解并定容至同一量瓶中,制成混合对照品溶液。2.4标准曲线的绘制精密吸取对照品溶液,用甲醇稀释配制成6个质量浓度水平。按2.1色谱条件,分别对不同质量浓度的对照品溶液进样分析,每个质量浓度重复测定3次,取峰面积平均值。分别以对照品的质量浓度X(mg·L-1)为横坐标,峰面积值Y为纵坐标绘制标准曲线,并计算回归方程,结果见表1。将混合对照品溶液用甲醇不断进行稀释后分析,得到6个成分的LOD,LOQ,结果见表1。2.5加样色谱条件分析取中间浓度的混合对照品溶液,同一天内连续进样6次,按2.1色谱条件分析,计录峰面积,结果6个成分峰面积的RSD分别为1.6%,1.9%,1.1%,1.6%,1.6%,2.2%,1.4%,3.0%。2.6个化学成分的测定取同一批卷柏药材6份,按2.2项下方法制备供试品溶液,按2.1色谱条件测定供试品中的6个成分。经计算,6个成分的保留时间及峰面积的RSD均小于3%,表明此方法重现性良好。2.7含量测定取同一份药材,按2.2项下方法制备供试品溶液。按2.1色谱条件,分别于0,2,4,12,24,48h测定(样品保存于4℃冰箱中)。经计算,6个成分的保留时间及峰面积的RSD均小于3.0%,表明供试品溶液在48h内稳定。2.8加样回收率测定精密称取已知含量的卷柏样品6份,每份1g精密称定,分别加入一定量的对照品,按2.2项下方法平行制备,按2.1项下方法进样分析,计算加样回收率。结果见表2。2.9种树资基苯磺酸钠样品含量测定精密称取不同来源的卷柏药材,按2.2项下方法制备供试品溶液,按照2.1项下色谱条件进行测定,进样10μL用回归方程计算各卷柏样品中6种成分的含量。结果见表3。3卷柏与垫状卷柏的含量测定本研究对提取溶剂,提取方式,检测波长进行了考察。从实验结果来看,selaginellins在280nm处吸收最强,双黄酮类化合物在337nm处吸收最强,故采用DAD检测器,选用280,337nm作为检测波长检测6种成分,效果满意;以75%乙醇为提取溶剂,药材量与溶剂量为1∶200时,回流提取2h即达完全。此方法且简便易行,重复性好。本研究对全国不同产地的10个批次卷柏和12个批次的垫状卷柏中selaginellins和双黄酮2类特征性成分的含量进行测定。结果显示,2种卷柏药材均含有以上2类特征性成分,二者的HPLC图较接近。4个双黄酮在卷柏与垫状卷柏中的含量分布呈现一定的规律性,即穗花杉双黄酮>扁柏双黄酮>异柳杉双黄酮>穗花杉双黄酮-7-甲醚。表明将二者同时入用为卷柏的原药材存在一定的合理性。含量测定结果亦表明,卷柏中穗花杉双黄酮的质量分数(5.628～9.184mg·g-1)普遍高于垫状卷柏(0.823～7.131mg·g-1);而selaginellin却相反,其在垫状卷柏中的质量分数(0.123～0.593mg·g-1)高于卷柏(0.067～0.133mg·g-1),多个批次