HIV实验室诊断文档

测是艾滋病实验室检测中最常用的方法，因为HIV抗体是患者感染HIV后最容易检出并且本的认识。实验室工作人员应特别注意病毒的结构、抗原组成，人体的免疫反应，诊断试验的基本原理、试验结果的解释，以及为了准措施。如果由于缺乏技术专长或基本知识而造成不正确的试验结果是不可原谅的。现将有年份美国首先在洛杉矶男性同性恋中发现5例以往很罕见的卡氏肺囊虫肺炎和26例卡波济氏肉瘤患者，这些病人均表现有严重的免疫缺陷，但原因不明。1982年将这种新的疾病命名为"获得性免疫缺陷综合征"Syndrome,AIDS,即艾滋病从艾滋病流行学资料分析很可能是由病毒引起的。法国巴斯德研究所Montagnier等首先从多发性淋巴结病综合症病人分离到一种新的逆转录病毒淋巴结病相关病毒美国国立癌症研究所RobertGallo等报道从艾滋病病人活检组织分离到一种新的逆转录病毒与其以前发现的HTLV-1和HTLV-Ⅱ不同。人类嗜T淋巴细胞Ⅲ型病毒typeⅢ,HTLV-Ⅲ美国加州大学分离出艾滋病相关病毒年份国际病毒分类委员会将上述病毒统一命名为人类免疫缺陷病毒Montagnier等又从西非病人体内分离出一种具有相似生物学特性，而致病性、抗原性及分子生物学特征有明显差别的新病毒，新发现的病毒命名为HIV-2,原来发现且已广泛流行的HIV称HIV-1。也至少有6个亚型(A-F)。在我国流行的是HIV-1,检测到的亚型有8种之多，其中B亚HIV病毒呈球形或卵圆形颗粒，直径100-140mm,具有包膜。包膜是在病毒出芽释放HIV-2的跨膜蛋白抗原称为gp36,而某些人则称之为gp41,又如主但在HIV-2又称P26。机体感染HIV后，HIV能够侵袭许多带有CD₄表面抗原的细胞(称CD₄+细胞),主要有由于感染HIV,细胞表面表达大量包膜糖蛋白，可以与周围细胞发生细胞膜融合，形成多核巨细胞。通过这种方式在细胞间播散病毒，可免受抗体的作用。HIV感染引起T₄细胞明显减少的机理主要由于：1、HIV直接杀伤T₄细胞；2、细胞融合间接地损伤T₄细胞；3、HIV感染T₄细胞，发生抗原性变化，引起自身免疫，通过调理吞噬作用损作T₄细胞，T₄细胞表面表达gpl20位点处吸着特异性抗体，通过抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)损伤T₄细胞。另外，由于T4细胞免疫功能损伤，B细胞对各种抗原产生抗体的功能也受到影响，使整个机体免疫功能严重破坏，导致各种机会性感染性疾病的发生。T₄细胞计数是反映临床症状的敏感信息，因此T₄淋巴细胞总数<200/mm³是诊断AIDS的重要指标。人体能对HIV的侵入产生抗体应答，通常是在HIV感染2-10周内机体产生抗体。但也有极少数人感染数月乃至数年后仍测不出抗体，故阴性结果并不说明受检者绝无感染。绝大多数人在感染过程中都会对各种病毒抗原成份产生免疫应答，抗体滴度可高达1:50000,但也可以很低。感染早期(血清阳转时)及病程后期(免疫缺陷)时，抗体滴度均较低。低滴度抗体血清学反应较弱，如果测定方法不够灵敏，可能导致假阴性结果。值得注意的是，并非每个HIV感染者对其所产生的免疫应答都完全相同。如某些人可能对P24有较强的应答。如果检测试剂主要是测定抗gp41的抗体，它就不太可能对仅有抗P24和gp120抗体的血清得出阳性结果。抗gag蛋白(P55、P24)抗体通常在感染早期即出现，抗env和pol产物的抗体同时或稍后产生。感染后至抗体出现前有段间歇期(2-6周，可长至3个月)大多数病毒感染者都有IgM抗体产生，但HIV感染者中似乎不完全有IgM应答。对于有IgM抗体应答者，在窗口期检出IgM抗体是有益的。HIV基因组可整合到宿主细胞DNA上使机体终身带有病毒，但机体可能很多年不出现症状，成为HIV无症状感染者，只是查血时发现抗一HIV阳性。尔后，在某些因素作用下，病毒被激活后并开始大量复制出现症状和各种合并症，则发展成艾滋病病人，HIV病毒很容易发生变异这是研制有效疫苗的主要困难之一。人体感染HIV后，血液中最先出现HIV抗原，然后很快消失直到疾病后期才重新出现。室诊断以抗体检测为主，病毒及相关抗原的检测为辅。抗体检测分为初筛试验和确证试验两种，初筛试验为阳性的血清必须进一步确证，确证为阳性的方可报告为HIV感染阳性。多聚酶链式反应(PCR)主要用于检测血浆中HIV的RNA含量，目前主要用于预测母亲将HIV传染给胎儿的可能性以及新生儿的HIV感染状况。此外，尚可用于判断病人的预后及监测抗病毒治疗的效果。(一)标本收集相对来说，对特异性要求不是太严，允许有少量假阳性，这些假阳性可以通过重复试验和等。这些实验使用的抗原早期是完整病毒的裂解产物，称为第一代试剂，这种抗原常常由于含有宿主细胞的成分而出现假阳性反应，为了获得可接受的特异性而稀释标本使试剂的敏感性也有所下降，同时这种抗原制备和纯化都比较困难，危险性大。第二代试剂使用重这类抗原制备也更为安全、容易、重复性好。应该注意的是重组抗原有时由于含有载体的组分而出现假阳性结果，多肽抗原由于缺乏合适的立体构象有可能使敏感性下降从而导致假阴性。使用重组或合成多肽抗原制备的双抗原夹心法试剂盒常常被称为第三代试剂，这种试剂可以检测针对HIV抗原的所有抗体亚类，包括IgG、IgA、IgM、IgE、IgD,同时不需要将标本过度稀释来保证特异性，因而具有较高的敏感性。第四代试剂除使用重组或合它具有准确性高、价格低廉、判断结果有客观标准、结果便于记录和保存等优点，适合于(1)方法和原理：使用最多的ELISA方法是间接法，这种方法的原理是将HIV抗原体结合，形成HIV抗原-HIV抗体-酶标记的抗人免疫球蛋白抗体复合物，最后加入底物-HIV抗体-酶标记HIV抗原复合物，最后加入底物发生酶催化的显色反应，测定光密度标记HIV抗体，如标本中的抗体浓度高，酶标记HIV抗体就不能HIV的酶标记HIV抗体将与固相载体上的HIV抗光密度值与标本中的抗体含量呈负相关关系。这种方法是将标本与酶标抗体同时加入，需将检测的阳性和(或)阴性对照的OD值代入厂商提供的计算公式计算出来的判断阳性和性结果的界值。对于间接法和双抗原夹心法，标本OD值与临界值的比值大于等于1(S/CO>1)为阳性；对于竞争法，标本OD值与临界值的比值小于等于1(S/CO≤1)为阳性。体，它们将与孔中的抗原结合。标本缓冲液用来减低孔中其它蛋白及抗体对孔壁的非特异强度与标本中抗体含量成正比。反应用EDTA终止，用酶标仪在405nm处测吸收峰而读取(1)方法和原理(2)结果判定②1:8血清稀释孔加25μ1非致敏粒子，1:16血清稀释孔加25μ1致敏粒子。明胶颗粒凝集试验22稀释度3(三)、确证(确认)试验a、膜条没有条带出现表示阴性(一)表示(+).(四)检验程度第一次检测第2次检测结果判定单分子或每10万个细胞中仅含1个DNA分子的样品。它是一种选择性体外扩增DNA或合成的新模板；因此，第二循环后延伸的模板由第一循环的4条增为8条，依此类推，以后每一个循环后的模板均比前一个循环增加1倍。理论上讲PCR扩增DNA产量是呈指数上升的。PCR技术具有特异性强、敏感性高、快速、简便、对起始材料质量要求低等特PCR用于检测HIV的优点如下：1.与传统检测抗体的方法相比，其灵敏度和特异性更高，从而对HIV的定量检测提供了有效的手段；2.不依赖于宿主的免疫反应，无须等到免疫系统对HIV产生抗体后才能检定宿主受HIV感染的状态，这有利于对血清阳转以前标本的检测和对阳性母亲所生婴儿的HIV感染的调查；3.对潜伏状态的HIV的检测不依赖于HIV在宿主细胞的生长活性。综上所述，PCR是对HIV核酸检测的有效手段，是对HIV病毒分离、血清学抗体检测方法的必要补充。在HIV感染的确诊和艾滋病诊断中，核酸的检测对病原活动的监控更加有效方便，因为核酸复制的有无和数量是体内病毒复制情况的直接反映。多聚酶链式反应(PCR)主要用于检测血浆中HIV的RNA含量，目前主要用于预测母亲将HIV传染给胎儿的可能性以及新生儿的HIV感染状况。此外，尚可用于判断病人的预后及监测抗病毒治疗的效果。四、艾滋病病原学诊断中的几个问题。实验出现的阳性结果，应再次重复实验，若仍为阳性，则应用确证实验去证实，只有确证和HIV-2,两型病毒间只有少部分抗原有交叉(主要是Gag基因编码的核蛋白)。因而各型病毒试剂只能有效地检测出同型病毒的抗体。法均无法查到病毒的存在，2周后出现病毒血症，此时可用抗原检测方法、检查病毒抗原或测定病毒逆转录酶活性，而不能用血清学方法，因为抗体要到感染后6-8周才会出现。此后就只能用抗体检测方法，直到艾滋病的出现，因为在这段时间HIV抗原很难从血清中查到，待发展到艾滋病阶段时才会重新出现。3、HIV抗体测定的灵敏度、特异度和预测值：检验结果抗体情况总计阳性有真的阳性(a)假的无假的阳性(b)真的所有阳性试验(a+b)所有阴性阴性阴性(c)都有抗体阴性(d)都无抗体试验(c+d) 敏感性：是指在有抗体存在的标本中，检出抗体的准确性。敏感性低的试验将有许多假特异性：是指在没有抗体存在的标本中，检测其抗体缺失的准确性。特异度低的试验将理想的是，一种试验应当具有100%的敏感性和100%的特异性。但实际上，没有一种都在99%以上。除非由于检验人员造成人为误差，这种检验方法所固有的特性是不会出现试剂的敏感性和特异性可以衡量它的优劣，但并不能决定一个测定结果正确与否的可阴性的结果是真阳性或真阴性的可能性。这除与所用试剂的优劣有关外，还取决于测定对恋人群可高达99.88%,而对正常人则为18.94%,反之，一个阴性结果的真实性对前者不足90%,而对后者则高达99.997%。表2ELISA法HIV-1抗体测定的预测值旧金山同性恋人群美国非高危人群等确定实验证实后方可报告。相反，对来自疫区的外国人或在疫区长期居住的归国人员可许多HIV抗体检测方法除了是一种定性实验外，还同时是一种半定量实验。这例如，表3中的HIV感染率为30/10万的正常献血员，中等强度反应时，HIV抗体阳性概率仅为1.13%,而在高强度反应时该概率则激增到86.1%,与同样强度的来自HIV感染率极高的吸毒人群(45000/10万)的概率相近。表3HIV感染机率与ELISA反应强度的关系ELISA反应强度(%)(/10万)非高危献血员高危献血吸毒者注：(1)数字表示相应强度反