氨海水与5-羟色胺对栉孔扇贝卵母细胞促熟作用的研究

氨海水与5-羟色胺对栉孔扇贝卵母细胞促熟作用的研究

在两个地壳之间的繁殖过程中，通常使用解剖法、卵和精，以避免过度精炼的现象。然而,贝类的卵子多是分批成熟分批产出的,解剖获得的卵子存在成熟度不够及发育不同步现象,对其进行体外促熟是必要的。目前关于贝类解剖卵的体外促熟研究报道不多,仅见于太平洋牡蛎(Crassostreagigas)、马氏珠母贝(Pinctadamartensii)、紫扇贝(Argopectenpurpuratus)、硬壳蛤(Mercenariamercenaria)、浪蛤(Spisula)等几种贝类中。已有的研究结果表明海水浸泡、维生素、氨海水(AmmoniaSeawater,AS)、5-羟色胺(5-HT)、组胺等对贝类的解剖卵都有一定的促熟作用。栉孔扇贝(Chlamysfarreri)是我国北方重要的养殖贝类,因其解剖卵无法完成受精作用,卵子都是通过自然产出或诱导排放的途径获得,迄今未有其解剖取卵、体外促熟的报道。本研究采用氨海水和5-羟色胺(5-HT)对栉孔扇贝的解剖卵进行体外促熟研究,通过对生发泡破裂(GerminalVesicleBreakdown,GVBD)情况和受精情况的分析来衡量2种试剂的促熟作用,探索扇贝解剖取卵、人工受精的可行性,最后通过氨和5-羟色胺的双因子处理建立了栉孔扇贝解剖获卵的体外促熟技术,该技术将在栉孔扇贝的繁殖和遗传操作中得到应用,并且对于建立相关类型贝类卵母细胞的体外促熟技术均有借鉴。1材料和方法1.1亲贝的选择与解剖实验用栉孔扇贝亲贝为青岛海区养殖的成熟2龄贝(壳长6.19cm±0.5cm,壳宽2.24cm±0.2cm,壳高6.65cm±0.6cm,体质量54.86g±3.5g)。亲贝经过暂养稳定后,挑选发育良好的亲贝,解剖获得精卵。将卵液用100目筛绢滤去较大组织块后,再用500目筛绢去除组织液和微小杂质;精液用300目筛绢过滤,选用上层,并检查精子活性。1.2浓度梯度设置室温(20℃)下,在几支15mL试管中加入等量卵液,再加入等量不同浓度的处理液,控制卵密度为500～1000个/mL,摇匀计时。氨海水单独处理时,处理浓度梯度设定为:0.0025%、0.005%、0.01%、0.015%、0.020%和0.025%(以分析纯氨水25%～26%为100%)。处理时间梯度为:15、30、45和60min。5-羟色胺单独处理时,处理浓度梯度设定为:0.001、0.002、0.003和0.004mol/L。处理时间梯度为:15、30、45和60min。联合处理时,选取前面2组中较好的浓度加以混合,并根据情况特别添加了先用氨海水浸泡再用5-羟色胺浸泡的处理组(T组)。处理时间同上。选用在正常海水中浸泡的卵母细胞作为对照,每次实验设3个平行组。1.3人力资源取出处理完毕的卵液,用500目筛绢过滤,洗去处理液,加入5mL小瓶中,再滴入1～2滴活力旺盛的精子,摇匀。受精过程中尽量多晃动。1.4gvbd的检测受精2～3h后,取样进行显微拍照,照片用于计算GVBD发生率、受精率。GVBD发生率=发生GVBD的细胞数/细胞总数×100%;受精率=正常卵裂的细胞数/细胞总数×100%;相对GVBD发生率=处理组GVBD发生率-海水组GVBD发生率。1.5数据计数最后的数据使用SPSS13.0统计软件进行双因子方差分析,以P<0.05作为差异显著水平。2结果2.1面为硬的贝类卵母细胞,体外通过gvbd或通过解剖获得的栉孔扇贝卵母细胞经过海水浸泡,生发泡依然未破裂(见图1A),有时也有例外(见2.3);处理后栉孔扇贝卵母细胞发生GVBD(见图1B);体外促熟的卵母细胞受精后,部分可以正常发育(见图1C);部分卵子促熟效果不明显,呈现不受精、发育过慢、发育畸形等情况(见图1D)。2.2时间依赖关系随时间处理时间的变化氨海水可以显著地促使栉孔扇贝卵母细胞生发泡破裂(见图2),除氨0.0025%组之外,其它浓度都达到了100%的GVBD发生率,海水对照组仅为6%,差异极显著(P<0.01)。卵母细胞经过氨海水处理后受精,如图3,除个别组与海水对照差异不显著外,都能极显著的提高受精率(P<0.01)。氨0.0025%处理组体现出一定的时间依赖关系随着时间从增加到受精率呈增长趋势,差异极显著(P<0.01),其它浓度处理没有时间依赖关系(P>0.05);相同的时间处理下,表现出一定的浓度依赖关系,15和30min时,氨0.005%与0.01%处理组受精率都高于其它组,差异极显著(P<0.01),45和60min时,氨0.005%处理组受精率高于其它组,差异显著(P<0.05)。氨海水最佳处理条件基本确定为:氨0.005%浓度,在处理时间15、30、45和60min时受精率分别达到了(13.28±2.14)%、(15.88±2.15)%、(15.34±1.41)%、(12.23±1.69)%,氨0.01%组在短时间处理时也不错,在15和30min时受精卵分别达到了(13.82±2.65)%和(12.55±2.44)%。2.35mol/l对krat时间依赖的影响栉孔扇贝解剖出的卵母细胞在海水中浸泡一段时间也有部分生发泡破裂,不同浓度和时间的5-羟色胺处理后,生发泡破裂率没有明显的提高,与海水对照组差异不显著(P>0.05)(见图4)。但经5-HT处理后,除0.004mol/L组外,受精率都明显高于对照组(见图5),差异极显著(P<0.01)。0.002mol/L处理组表现出一定的时间依赖性,受精率随着处理实践的延长而增高,处理45min时受精率达到最大(24.74±1.33)%;处理时间增加至60min时,受精率有所降低,但差异不显著(P>0.05)。其它浓度处理组没有表现出明显的时间依赖性。相同时间处理下,表现出较强的浓度依赖性,除15min外,其它处理时间下,0.002mol/L组受精率都明显高于其它组,差异极显著(P<0.01)。2.4混合中的时间依赖关系使用氨海水最适浓度0.005%与不同浓度5-羟色胺混合处理时,受精率极低,只有一部分生发泡破裂。如图6所示,最高的相对GVBD发生率只有(8.48±0.11)%,低于氨海水单独作用,说明氨水的作用受到5-羟色胺的抑制。适当提高氨海水浓度,与5-羟色胺混合处理,GVBD发生率达到100%。考虑到2种试剂间的相互干扰,特别添加了T组,即先后用最适条件的氨海水和5-羟色胺处理。在混合处理中,氨0.010%与5-HT0.001mol/L混合取得最好效果,处理时间在15～30min间受精率变化不明显,为(24.09±1.13)%～(25.57±0.46)%之间高于氨海水单独处理如图7所示,除c组与d组浓度下45与60min处理外,其它各组受精率都显著高于对照组(P<0.01)。时间依赖性上,T组在45min受精率高于其它时间处理,差异显著(P<0.05),其它浓度没有时间依赖性;相同时间处理时,在15min、30min时T组与200+1组差异不显著(P>0.05),但高于其它浓度组(P<0.01),在45min时,T组受精率高于其它浓度组(P<0.01)。而用最适浓度的氨海水和5-羟色胺相继处理的T组在处理45min时表现出了整个实验最好的诱导效果,受精率达到(40.02±2.73)%,明显高于混合处理和单独处理(P<0.001)。3讨论3.1外部促熟方法双壳贝类精子入卵的时机有2种,1种是初级卵母细胞处于第一次减数分裂之前,如卵生型牡蛎、中国蛤蜊;另一种是初级卵母细胞生发泡已经消失,初级卵母细胞处于第1次减数分裂中期,如扇贝、菲律宾蛤仔。对于第1种类型的贝类,解剖获得卵母细胞可以直接用于受精,但是,适当的体外促熟可以提高卵母细胞的同步性,提高受精率。王昭萍等以太平洋牡蛎的剥离卵子为材料进行体外促熟,采用海水浸泡及维生素处理等方法促进成熟较差的卵子进一步成熟,获得了成功;任素莲等利用海水、氨海水中浸泡使太平洋牡蛎的剥离卵生成泡破裂,促进卵子的继续发育,卵子在氨海水中的发育速度要快于在纯海水中的发育速度;沈亦平等利用氨水和海水对解剖获取的马氏珠母贝卵子的促熟过程进行了比较研究。对于第2种贝类,由于解剖获得的卵母细胞处于前期,直接受精无法完成,所以多采用阴干等方法进行催产,体外促熟的研究比较少,氨海水体外促熟的方法在缢蛏、旗江珧等贝类中有所应用,但是效果一般;Gloria等利用组胺对紫扇贝卵子进行体外促熟,避免了雌雄同体的自交。栉孔扇贝也属于第2种类型的贝类,目前还未见关于其解剖取卵及体外促熟的报道。本研究采用氨海水和5-羟色胺(5-HT)对栉孔扇贝的解剖卵进行处理,发现氨海水能有效地促使卵母细胞生发泡破裂,GVBD发生率可高达100%;5-羟色胺对生发泡破裂无明显作用,但可以显著的提高生发泡已经破裂的卵母细胞的受精率,氨海水与5-羟色胺的联合处理使得栉孔扇贝解剖卵受精率达40%,这为进一步的试验及应用提供了良好基础。3.2抗寒性作用激活水回复突变体的生长和发育作用卵母细胞的成熟过程对动物卵子的受精以及以后的发育过程是至关重要的。解剖获得的栉孔扇贝的卵母细胞处于前期I阻滞状态,经过激活,会在第1次减数分裂的中期发生第2次阻滞,之后通过受精作用的激活完成整个减数分裂过程,并进一步发育。在已有的研究中,生发泡破裂(GVBD)通常被认为是卵母细胞成熟的标志,意味着卵母细胞启动了减数分裂然而本研究发现生发泡破裂并不意味着卵母细胞的真正成熟。经解剖获得的栉孔扇贝卵母细胞有时会有部分生发泡已经破裂,但是这部分卵母细胞无法完成受精和分裂。同样,用一定浓度的氨海水(0.005%～0.025%)处理栉孔扇贝卵母细胞,可以显著的促使生发泡破裂,GVBD发生率达到100%,但是受精率依然不高,表明生发泡破裂之后只有少量卵母细胞能进一步完成成熟过程。生发泡破裂可能只是是重新启动减数分裂的第一步,由生发泡破裂到第1次减数分裂中期这一过程却不一定能实现,依然需要激活。5-HT可以显著的提高生发泡已经破裂的卵母细胞的受精率,表明5-HT正是起到了这种激活作用。由此可以看出,对栉孔扇贝来说,生发泡破裂是卵母细胞成熟的必要条件,而非充分条件,生发泡破裂之后需要进一步的激活才能使卵母细胞进入到成熟过程。3.3不同浓度5-ht的混合系统本研究表明,氨海水能有效地促使卵母细胞生发泡破裂,而5-羟色胺可以显著的提高生发泡已经破裂的卵母细胞的受精率,充分表明氨海水和5-HT对扇贝解剖卵的促熟作用具有一定的互补性。Loosanoff提出在海水中加入氨海水溶液,可促使双壳类(如TapesSedidecussata)卵母细胞生发泡的破裂,有利于卵的受精。方永强进一步肯定了氨海水是菲律宾蛤卵母细胞达到生理成熟的必要因子,并提出氨海水是通过激发核与细胞器的物质和能量代谢来实现激活作用的。在本研究中,氨海水在一定浓度下可以显著的促使栉孔扇贝卵母细胞生发泡破裂(见图2),但是这种初步的作用并没有得到可观的受精率,最高只有15%左右(见图3),可能是因为氨海水的促熟作用比较初步,无法对卵母细胞的重要调控因子(如成熟促进因子MPF、有丝分裂原激活的蛋白激酶MAPK、环磷酸腺苷cAMP等)起到关键的作用。5-HT作为1种信号分子,可以与卵母细胞膜表面的G蛋白(GTP结合调节蛋白)偶联受体结合,导致细胞内产生第二信使,从而将胞外信号跨膜传递到胞内影响细胞的行为。G蛋白偶联受体所介导的细胞信号通路主要包括cAMP信号通路和磷脂酰肌醇信号通路。目前的研究发现,这2条通路都参与了双壳贝类卵母细胞的成熟过程。王清等研究了cAMP信号通路在5-HT诱导硬壳蛤卵母细胞成熟过程中的作用。本研究中,5-HT在所用的浓度范围内对栉孔扇贝卵母细胞的生发泡破裂没有作用(见图4),但是对已经发生生发泡破裂的卵母细胞可以进一步的激活,受精率虽然最高也只有25%左右(见图5),但是相对于只有37%的GVBD发生率,激活效率很高。大多数情况下,解剖出的卵母细胞生发泡破裂率很低,所以单独使