黄芪对糖尿病大鼠肾脏的保护作用机制

黄芪对糖尿病大鼠肾脏的保护作用机制

氧化应激是糖尿病肾病的发病机制之一。临床与实验研究都发现应用抗氧化剂可延缓糖尿病肾病进程。黄芪提取物主要成分黄芪总酮、黄芪总皂甙等其药理作用有较强的抗氧化作用,初步发现其能降低蛋白尿,改善肾小球结构异常。本研究旨在进一步探讨黄芪对糖尿病大鼠肾脏的保护机制,为黄芪在糖尿病肾病的治疗提供更加有力的实验依据。1免疫组化检测肾皮质中k-n-sod和gsh-px、mda、nos的表达本实验于2005年1月～2005年5月取健康雄性wistar大鼠,体重200～250g,30只。随机抽取20只禁食12h,采用60mg·kg-1STZ溶于0.1mmol·L-1柠檬酸缓冲液一次性腹腔注射,对照组则注射等量的柠檬酸缓冲液。连续监测血糖3d,持续血糖浓度>16.6mmol·L-1,确定为糖尿病模型形成。将大鼠分为3组。A组:空白对照组(n=10);B组:糖尿病模型组(n=10);C组:糖尿病6周后+黄芪注射液(中科院成都地奥制药公司生产)组(n=10)。C组6周后20mg·kg-1·d-1,尾静脉注射给药。不应用胰岛素,整个实验观察8周。实验开始后第1,8周将动物分别放入代谢笼收集24h尿液,测定尿量,并用1%戊巴比妥钠1.0ml腹腔注射麻醉,心脏抽血2ml。测定血肌酐、计算肌酐清除率。用酶标法计算尿微量白蛋白排泄率(UAE)。8周后将动物处死,取左侧8mm3肾皮质在分析天平上称重,制成10%组织匀浆,离心,测定肾皮质SOD、GSH-Px、MDA、NO2-/NO3-和NOS。取右侧肾脏用1%福尔马林固定,经脱水、透明石蜡包埋、切片3μm行PAS染色及5μm行Ⅳ胶原免疫组化制片,光镜检查。⑴肾皮质NO2-/NO3-和NOS:NO2-/NO3-和NOS含量采用硝酸还原酶法(南京建生成物工程研究所)。⑵肾皮质T-SOD和CuZn-SOD、GSH-Px、MDA:T-SOD和CuZn-SOD活性采用联苯三酚自氧化法,GSH-Px活性采用NADPH耦联法,MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法(南京建生成物工程研究所)。⑶肾小球PAS染色病变程度分析:在高倍镜下顺序观察每张切片皮质部分5个肾小球,用Leica5001W型图像分析仪定量测量每个肾小球面积(GA),肾小球内ECM面积。结果用ECM/GA表示。⑷免疫组化Ⅳ胶原阳性物质表达:石蜡切片常规脱蜡,加入兔抗大鼠Ⅳ胶原多克隆抗体4℃过夜,再加生物素化二抗室温30min,滴加链酶亲和素-生物复合素,室温30min,滴加DAB显色液(武汉博士德公司试剂盒),镜下控制着色时间,苏木素复染,常规脱水、透明、封片。阳性物质呈棕色带状沉积。同样应用上述图象分析软件计算阳性指数(PI):[阳性信号面积×平均阳性强度(平均灰度值)]/肾小球面积,取平均值。采用SPSS10.0统计软件包,实验结果以x¯±sx¯±s表示各组间比较采用单因素方差分析及t检验。2各组肾皮质相关指标的变化B、C组大鼠腹腔注射STZ,连续3d,血糖>16.6mmol·L-1即DM模型形成,以后每周测定血糖>16.6mmol·L-1,尿糖3+～4+至实验结束。第1周末开始B、C组Ccr、UAE较A组明显升高(P<0.01)。第8周末B组Ccr较C组明显降低(P<0.01),A、C组之间差异无统计学意义;B、C组UAE较A组明显升高(P<0.01),C组较B组明显降低(P<0.01)(表1)。B、C组肾皮质T-SOD、GSH-Px显著低于A组,但C组较B组明显升高,B、C组肾皮质MDA含量显著高于A组,但C组较B组明显降低。B组肾皮质NO2-/NO3-和NOS显著低于A组(P<0.05),C组显著高B组(P<0.01),A、C组之间差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。2·4肾小球病理形态及免疫组化变化3dm和氧化应激作用糖尿病肾病(DN)是在代谢紊乱与血流动力学基础上,以高糖诱导的活性氧(ROS)、各种生长因子、血管活性物质综合作用的结果。活性氧通过对肾小球内皮、上皮及系膜细胞的直接损伤和趋化作用,吸引中性粒细胞及单核巨噬细胞在血管周围及血管内浸润,从而改变肾小球毛细血管和基底膜的通透性及肾小球内血液动力学,造成大量持续性蛋白尿。DN发展中自由基产生不断增多,体内抗氧化酶活性下降,信使蛋白结构和功能改变,使NO灭活。NO作为内皮细胞舒张因子可使细胞外基质合成减少,分解增加而防止肾小球基质中胶原纤维的积聚。研究发现,肾小球系膜区和基底Ⅳ胶原在DM时明显增加。主要因为高糖和AGEs使ROS产生,ROS活化PKC、MAPK和JAK-STAT通道,导致氧化应激转染因子如NF-κB,AP-1,STAT和Egr-1迅速活化,从而增强TGF-β和CTGF基因编码的转活化使ECM蛋白表达上调。资料报道,DM时NAPCD氧化和eNOS解偶联导致肾小球ROS产生,而氧化应激可使NOS亚型表达下调,ROS介导的脂质过氧化增加,用胰岛素加抗氧化剂能够使NOS亚型和ROS恢复正常。体外实验证明,黄芪水提取物黄芪总酮(TFA)、黄芪总皂甙(TSA)等,均有清除超氧阴离子自由基作用,从而抑制膜脂质过氧化。SOD可以歧化O⋅¯2Ο⋅¯2生成H2O保护细胞不受氧自由基的损伤。糖尿病时,肾脏自由基防御机能下降,肾脏抗氧化酶活性减弱。黄芪抗氧化作用的机制一方面是对LPO直接作用,而主要是通过显著升高SOD活性而清除氧自由基。本研究表明黄芪可明显减轻糖尿病大鼠蛋白尿,改善肾小球滤过率,可能是由于黄芪对氧自由基的清除,使肾小球基底膜损害降低所致。笔者发现黄芪具有显著增加NOS活性,增加组织抗氧化酶活性作用,使ROS产生减少,可能通过PKC、MAPK和JAK-STAT通道,减轻糖尿病鼠肾小球GMB增厚及系膜区基质增生,延缓肾小球硬化进程,因此认为,黄芪作为一种传统廉价中草药,具有广泛的临床应用价值。11动物和组成12样品收集13各种指标的测定1小鼠血清中pas活性变化2·1实验大鼠血糖变化2·2实验大鼠Ccr、UAE变化2·3氧化应激指标及NO2-/