第1章 基因工程的基本概念 yu

云南大学2015春季必修课程基因工程云南大学余敏Emailyumin@

生命科学与生物技术的理论体系研究对象研究层次量子分子细胞组织个体群体细菌真菌病毒植物动物人类遗传生理生物生态仿生分子生物学细胞生物学化学工程生命科学生物工程生物技术研究内容生命科学理论与技术3

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细胞生物学基础分子免疫学基础生物技术与生物工程2

分子生物学基础细胞生物学基础A细胞的结构与功能B细胞的分裂与增殖C细胞的衰老与凋亡D细胞的生长与分化E细胞的物质运输F细胞的信号传递分子生物学基础分子生物学的三大基本内容：生物大分子的结构与功能（结构分子生物学）基因的表达和调控机制（中心法则）分子生物学实验技术（实验分子生物学）遗传信息传递的中心法则DNA（基因）DNA（基因）mRNA蛋白质生物代谢物质复制转录翻译代谢基因组学转录组学蛋白组学代谢组学逆转录生物大分子的结构与功能DNA（基因）蛋白质多糖指导合成关系核酸脂类相互作用关系基因工程5

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基因工程的基本概念基因工程的基本原理基因工程所需的基本条件基因工程的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建大肠杆菌基因工程酵母基因工程哺乳动物基因工程高等植物基因工程D基因工程的基本形式1基因工程的基本概念C重组DNA技术与基因工程的基本用途B基因工程的基本定义A重组DNA技术的基本定义E

基因工程的发展A重组DNA技术的基本定义1基因工程的基本概念

重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。B基因工程的基本定义1基因工程的基本概念

基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。C重组DNA技术与基因工程的基本用途1基因工程的基本概念分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源大规模生产生物活性物质设计、构建生物的新性状甚至新物种大规模生产生物活性物质工程细胞基因工程蛋白质工程途径工程发酵工程细胞工程分离工程酶酶工程分离工程天然细胞天然细胞生物活性物质有多个术语表述基因工程：基因工程（geneengineering）;遗传工程（geneticengineering）;基因操作（genemanipulation）;重组DNA技术（recombinantDNAtechnique）;基因克隆（geneclone）;分子克隆（molecularclone）等等。现在人们的基因工程，主要是强调通过基因操作，改变生物的性状，获得人类需要的某些产品或生物性状。D基因工程的基本形式1基因工程的基本概念第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表达经典基因工程第二代基因工程蛋白编码基因的定向诱变蛋白质工程第三代基因工程代谢信息途径的修饰重构途径工程

第四代基因工程基因组或染色体的转移基因组工程现代生物工程技术蛋白质工程细胞组织工程酶工程发酵工程基因工程1基因工程的基本概念

基因工程在现代生物工程技术中的地位蛋白质工程的概念

在利用基因工程技术了解编码蛋白质的基因的基础上，对蛋白质的氨基酸序列、结构和功能进行分析;进而通过对蛋白质的结构、氨基酸序列的改造和翻译后的修饰等手段，改变甚至创造出新的和更有效的蛋白质。蛋白质工程主要内容主要目标蛋白质氨基酸序列的分析蛋白质晶体结构分析蛋白质功能预测和分析蛋白质组分析细胞（组织）工程概念组织工程：利用移植的细胞、骨架、DNA、蛋白质或蛋白质片段替代或修复已受伤或损坏的组织和器官生物加工工程：利用活细胞生产生物医药产品组织工程——人造器官王正敏

干细胞：1999年4月，美国的科研人员首次成功地从成年人骨髓的干细胞在体外培养分化出软骨、脂肪和骨骼细胞。标志着干细胞的研究取得了重大进展。以这项技术为代表的组织工程的突破具有广阔的应用前景，在不远的将来为实现人造“器官”成为可能。酶工程的概念是酶学与工程学的相互渗透和结合所发展起来，以酶为研究对象，改造并应用酶的特异催化功能。目标就是通过工程化技术大规模生产和转化相应原料成为有用物质的技术

酶工程的主要内容酶的分离纯化酶与细胞的固定化技术及反应器酶制剂的发酵生产酶分子化学修饰、遗传突变及结构改造酶抑制剂与激活剂开发与研究人工设计与合成模拟酶及酶分子发酵工程

发酵工程属于生物技术的下游技术，是工业化大规模培养细胞、生产生物制品的一种技术。传统的发酵工程主要用于微生物。现代生物技术还包括动物、植物细胞和工程菌的发酵培养。

1、基因工程理论基础—三大理论发现（1）20世纪40年代：证明了遗传物质是DNA

1865年G.J.Mendel的豌豆杂交试验20世纪20-30年代确认自然界有DNA和RNA两类核酸，并阐明了核苷酸的组成1944年O.T.Avery肺炎球菌转化实验1952年A.D.Hershey和M.Cha-se用DNA35S和32P分别标记T2噬菌体的蛋白质和核酸，感染大肠杆菌（一）基因工程的诞生

E基因工程的发展

肺炎双球菌转化实验有荚膜（S型）无荚膜（R型）非致病（2）1953年Watson和Crick：DNA双螺旋结构（3）1958～1971年：先后确立中心法则,破译64种密码子，揭示了遗传信息的流向和表达确定了遗传信息的传递方式

B技术上的3大发明：

1．“基因剪刀”－限制性内切酶的发明

（1）20世纪40－60年代，科学家们就为基因工程设计了美好的蓝图，但是面对庞大的dsDNA（104，2.2*1011公里）束手无策，无从下手把它切成单个基因片断。（2）当时的酶学知识已有相当的发展，但是没有一个已发现的酶能完成这样的使命。（3）1970年，Smith和Wilcox在流感嗜血杆菌（Haemophilusinffuenzae）分离纯化了HindⅡ，取得了突破，打破了基因工程的禁锢，迎来了改造生物的春天，为基因工程奠定了最为重要的技术基础。RestrictionenzymerestrictionendonucleaseenzymethatcutsDNAstrandsatspecificsitesLigaseenzymeusedtojointwopiecesofDNA

2．载体(“交通工具车子”)－基因工程技术诞生的第二个技术准备

（1）

有了切割与缝合（ligase）基因DNA的工具，还得有一个载体将重组DNA送到宿主细胞中去。（2）1946年起，Lederberg就研究细菌性因子（F因子）.50-60年代相继发现了R因子（抗药因子），CoE(大肠杆菌因子)等质粒。（3）1972年Berg首次实现基因重组(将SV40病毒DNA与噬菌体P22DNA在体外重组成功)----第一个重组DNA分子，1980年诺贝尔化学奖1973年Cohen才能将质粒作为基因工程载体使用（至今一直是基因工程最重要最广泛使用的载体）。这是基因工程的第二个技术准备。vectoranagentsuchasaplasmidusedtotransferDNAintoahostcellImportanceofE.coliThe“laboratorymouse”ofbacteriaUsedingeneticengineering

3．逆转录酶－1970年Baltimove和Temin等同时各自发现了逆转录酶，打破了遗传学（生物学）中心法则，使真核基因的制备成为可能。（？？？）(1)真核基因组庞大而复杂，不易制得基因图谱。HGP2005年完成，2.8万个基因，1－3kb/基因，104，2.2*1011公里。（2）即使有了基因图谱，因为真核基因有内含子，不能在原核表达系统剪接出mRNA，没有成熟的mRNA就不能得到相应得产物。（3）经过逆转录mRNA→cDNA(complementoryDNA)文库要比基因组文库小得多，所以筛选阳性克隆就方便得多。

1973年，Cohen等获得了抗四环素和新霉素的重组菌落TcrNer----标志着基因工程的诞生。NerNerNer第一个转化成功的重组DNA

基因工程的发展E基因工程的发展1976年等首先将人工合成的生长激素释放抑制因子somatostatin14肽的基因重组入质粒，成功地在大肠杆菌中表达1977年美国南旧金山由Boyer和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1978年Itakura（板仓）等使人生长激素191肽在大肠杆菌中表达成功1979年美国基因技术公司用人工合成的人胰岛素基因（HGH）重组转入大肠杆菌中合成人胰岛素1980年，美国/瑞士人，a干扰素－基因；1984年，日本人，白细胞介素2（IL-2）；（三）基因工程的腾飞1980年：显微注射培育出第一个转基因动物—转基因小鼠，1982年，美国，大鼠生长激素基因转入小鼠----巨鼠1983年，美国，农杆菌介导培育出第一例转基因植物—转基因烟草1990年，美国，腺苷脱氨酶（ADA）基因治疗，重度联合免疫缺陷症（SDID）1991年，美国倡导，人类基因组计划109bp，15年时间30亿USD；1997年，美国人，威尔英特克隆多利绵羊

基因工程药物的类型：

1.生长因子，如胰岛素，白细胞介素等；

2.活性蛋白因子，如干扰素等；

3.酶类，如链激酶，尿激酶等；

4.疫苗，如乙肝疫苗等；

5.抗体，用作治疗的人源化抗体；

6.诊断试剂。胰岛素人生长激素干扰素白细胞介素2粒细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子红细胞生成素EPO组织纤溶酶原激活剂生长激素促生长素抗血友病因子Ⅷ脱氧核糖核酸酶葡糖脑苷脂酶鼠单克隆抗体已上市的基因工程药物BenefitsofRecombinantBacteria1.Bacteriacanmakehumaninsulinorhumangrowthhormone.2.Bacteriacanbeengineeredto“eat”oilspills.TransgenicorganismsWhenanorganismcontainsgenesfromotherorganisms.Example:AtobaccoplantthatcontaindDNAfromafirefly.TheDNAofplantsandanimals

canalsobealtered.

PLANTSdisease-resistantandinsect-resistantcrops2.Hardierfruit3.70-75%offoodinsupermarketis

geneticallymodified.TransgenicorganismsGenefromArcticcharfishinsertedintotomato=Frost-resistanttomatoTransgenicplantsUsuallycashcropssuchascotton,corn,wheat,soybeans,etc.OftenincorporatesbacterialDNAtomakethecropresistanttodisease,pests,orchemicals.Ex:Btcorn苏云金芽孢杆菌

HowtoCreateaGenetically

ModifiedPlant1.Createrecombinantbacteriawithdesiredgene.2.Allowthebacteriato“infect"theplantcells.3.Desiredgeneisinsertedintoplantchromosomes.SelectiveBreedingBreedonlythoseplantsoranimalswithdesirabletraitsPeoplehavebeenusingselectivebreedingfor1000’sofyearswithfarmcropsanddomesticatedanimals.GeneticallymodifiedorganismsarecalledGMOTRANSGENICANIMALSMice–usedtostudy