高通量测序技术简介

高通量测序应用与进展报告纲要高通量测序简介高通量测序平台的介绍高通量测序的应用范围及案例分析相关生物信息学分析软件介绍高通量测序简介高通量测序:一次性对几百万到十亿条DNA分子进行并行测序，又称为下一代测序技术，其使得可对一个物种的转录组和基因组进行深入、细致、全貌的分析，所以又被称为深度测序。High-throughputSequencingNextGenerationSequencingDeepSequencing3高通量测序流程文库扩增低通量ASanger测序B高通量测序并行测序

高通量无需建立文库，

两端加测序接头PCR扩增报告纲要高通量测序简介高通量测序平台的介绍高通量测序的应用范围及案例分析相关生物信息学分析软件介绍高通量测序技术的起源与发展1992年LynxTherapeuticsMPSS2003年PolonySequencing（哈佛）2005年454Pyrosequencing2006年SolexaSequencing-by-Synthesis2007年ABISOLiD2008年HelicostSMSSequencing2010年IontorrentSemiconductorSequensing2011年PacificBiosciencesSMRTSequensing6高通量测序技术的传承关系图LynxMPSSSolexaABISOLiD454IonTorrentHelicosSMRTIlluminaSolexaRoche454PolonySeqABIIonTorrent现有主要高通量测序仪开发商测序仪品牌技术原理开发商Roche454焦磷酸测序RocheIlluminaSolexa边合成边测序IlluminaABISOLiD基于磁珠的大规模并行连接测序ABIHelicos单分子荧光测序HelicosIonTorrent半导体测序ABISMRT单分子实时测序PacificBio454Pyrosequencing基于磁珠的焦磷酸测序：A磁珠制备设备B454测序仪C454测序原理454测序流程454测序流程与BaseCalling454的特点与主要应用读长较长，400－600bp通量较低，1Run1M序列，400－600Mb相对成本较高主要应用：denovo测序IlluminaSolexa简介桥式PCR边合成边测序可逆终止物HiSeq2000IlluminaSolexa测序流程IlluminaSolexa桥式PCRdioldiol 1stcycledenaturation1stcycleannealingdioldioln=35total1stcycleextensiondioldioldioldiol2ndcycledenaturation2ndcycleannealingdioldioldioldioldioldiol2ndcycleextensionIlluminaSolexaBaseCalling123789456TTTTTTT

G

T…T

G

C

T

A

C

G

A

T…Solexa的特点与主要应用读长较短，100－150bp通量高，25G每天，120-150G每Run主要应用：RNA测序、表观遗传学研究ABISOLiD简介SOLiD

SequencingbyOligoLigation/DetectionOligo连接测序：通过连接酶连接，再对oligo上荧光基团进行检测SOLiD5500xlABISOLiD测序前期制备A样品片段化磁珠连接B乳化PCR3‘末端修饰C磁珠富集转到测序玻片ABISOLiD测序原理ABISOLiD荧光结合和结果示例@SRR029969.1VAB_5551_12_381_F3length=35T11.0203.3.1113211010332111302330201+SRR029969.1VAB_5551_12_381_F3length=35!36!8/8:!:!462>@6=(<8>8.<;2:*9748078@SRR029969.2VAB_5551_13_468_F3length=35T202312302.3333130131131322113203131+SRR029969.2VAB_5551_13_468_F3length=35!9),4/3)&$!(&(573(96,'7&91>)43),(95,A.SOLiDOligo荧光基团模式图B.SOLiD测序结果示例（ColorSpace)SOLiD的特点与主要应用读长较短，50-75bp精度高，可达Q40通量高，20-30G每天，1Run可达120G主要应用：基因组重测序、SNP检测等三种平台的技术差异平台454SolexaSOLiDPCR磁珠乳化PCR桥式PCR磁珠乳化PCR测序载体磁珠玻片玻片测序方式焦磷酸、荧光可逆终止物、荧光连接酶、荧光结果序列FastQFastQCSFastQ三种平台的效能参数差异平台读长通量周期精度SolexaHiSeq2000Single-end:1x35bpPaired-end:2x50bpPaired-end:2x100bp25Gb/d~1.5d~4d~8d•50bp85%以上Q30

•100bp80%以上Q30SOLiD5500xlSingle-end:75bpPaired-end:75x35bpMate-pair:60x60bp20–30Gb/d1d/1lane7d/12lane7d/12laneQ40454GSFLX400-600bp400–600Mb/Run10hQ20报告纲要高通量测序简介高通量测序平台的介绍高通量测序的应用范围及案例分析相关生物信息学分析软件介绍高通量测序应用范围DNA测序

全基因组denovo测序

基因组重测序

宏基因组测序

人类外显子组捕获测序RNA测序

转录组测序

小RNA测序

电子表达谱测序表观基因组研究

ChIP-Seq

DNA甲基化测序基因组测序基因组测序是对物种的基因组DNA打断后进行高通量测序，根据是否有已知基因组数据主要分为denovo全基因组测序和基因组重测序。Denovo基因组测序是对未知基因组序列的物种进行基因组从头测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组图谱。全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。基因组测序策略Paired-EndMate-End基因组测序流程－两种测序策略Paired-end原理29100bps100bps3000bpsPaired-end基因组重排分析

Paired-end和测序深度对测序效果的影响JunWang,etal.Nature456,60-65(6November2008)基因组测序的生物信息学分析数据产出处理：图像识别与BaseCalling\去除接头序列、检测与去除污染序列等；基因组组装：原始数据统计、测序深度分析、组装结果统计等；基因组注释：CodingGene注释、RNA分类注释、重复序列注释等；基因功能注释：GO功能分类、Interpro功能分类等；比较基因组及分子进化分析：SNP/InDel/CNV检测等。References1、ErinD.Pleasance,PhilipJ.Stephens,SarahO’Meara,etal..Asmall-celllungcancergenomewithcomplexsignaturesoftobaccoexposure.Nature,2010,463:184-190.2、MichaelJamesClark,NilsHomer,BrainD.O’Connor,etal..U87MGDecoded:TheGenomicSequenceofaCytogeneticallyAberrantHumanCancerCellLine.PloSGenetics,2010,6(1):e1000832.3、WeiChen,ReinhardUllmann,ClaudiaLangnick,etal..Breakpointanalysisofbalancedchromosomerearrangementsbynext-generationpaired-endsequencing.EuropeanJournalofHumanGenetics,2010,18:539-543.4、VanTassellCP,SmithTP,MatukumalliLK,TaylorJF,SchnabelRd,etal.Whole-genomesequencingandvariantdiscoveryinC.elegans.NatMethods,2008,5(2):183-188.5、JunWang,WeiWang,RuiqiangLi,etal..ThediploidgenomesequenceofanAsianindividual.Nature456,60-65(6November2008)6、HuangSW,LiRQ,WangJ,etal.TheGenomeoftheCucumber(CucumissativusLinnaeus).

NatureGenetics2009;doi:10.1038/ng.4757、DavidHernandez,etal.Denovobacterialgenomesequencing:Millionsofveryshortreadsassembledonadesktopcomputer.GenomeRes.

2008.18:

802-80933基因组重测序案例分析ErinD.Pleasance,etal.Thecompendiumofsomaticmutationsinasmall-celllungcancergenome.Nature,2010,463:184-190.此研究用高通量测序对一个小细胞肺癌细胞系NCI－H209基因组进行重测序，以探讨吸烟引发该细胞系基因组中特定碱基及其周围序列的突变及细胞损伤修复原理。肺癌基因组变异情况统计图基因组重排和CNV分析从头基因组测序案例DavidHernandez,etal.Denovobacterialgenomesequencing:Millionsofveryshortreadsassembledonadesktopcomputer.GenomeRes.

2008.18:

802-809此研究对Staphylococcusaureus

strainMW2和Helicobacteracinonychis

strainSheeba两种细菌基因组进行从头测序，并比较了几种拼接方法的效果。多种拼接软件拼接结果比较多种拼接软件拼接结果比较五种拼接方法的拼接结果比对宏基因组测序宏基因组测序是对某一特定环境，如肠道、土壤、海水等中的所有微生物进行基因组测序。通过此方法可对该环境中的微生物种类和优势物种进行检测，揭示微生物群落多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系。自然环境中很多微生物无法分离培养，而此方法无需对微生物进行分离培养。宏基因组测序方法现在有全基因组的宏基因组测序和16S/18SrRNA宏基因组测序。全基因组的宏基因组测序通过高通量测序技术，对环境样品的总DNA直接进行全基因组的宏基因组测序，能够实现微生物群落的物种分类研究、群落结构、系统进化、功能注释以及物种间的代谢网络研究，挖掘具有应用价值的基因资源，开发新的微生物活性物质。与传统的Sanger法相比，速度快，性价比高，周期短，单个样品的测序量可以接近饱和。宏基因组测序信息分析主要内容拼接组装物种分类组成分析基因预测和功能注释生成Profilingtable主成分分析（PCA）筛选与样品分组显著相关的因子多样品间比较分析16S/18SrRNA宏基因组测序16S/18SrRNA是微生物群落分析和细菌进化研究以及分类研究最常用的靶分子，采用新一代测序技术，对16S/18SrDNA的可变区进行测序分析，不需进行克隆筛选，能全面的反映微生物群体的物种组成，真实的物种分布及丰度信息。16S/18SrRNA测序信息分析内容物种分类、物种丰度分析OTU（Operational

TaxonomicUnits）分析多样性分析系统进化分析多样品间的比较分析ReferencesMeyer,F;PaarmannD,D'SouzaM,OlsonR,GlassEM,KubalM,(2008)."ThemetagenomicsRASTserver-apublicresourcefortheautomaticphylogeneticandfunctionalanalysisofmetagenomes".

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JBioinformComputBiol.

8

(6):995–1011.人类外显子组捕获测序外显子组是指全部外显子区域的集合，该区域包含合成蛋白质所需要的重要信息，涵盖了与个体表型相关的大部分功能性变异。

与全基因组重测序相比，外显子组测序只需针对外显子区域的DNA，覆盖度更深、数据准确性更高，更加简便、经济、高效。46人类外显子组捕获测序原理人类外显子组捕获测序分析流程检测序列变异分析示例检测到SNP数统计序列InDel检测References1、WeiX,

WaliaV,

etal.ExomesequencingidentifiesGRIN2Aasfrequentlymutatedinmelanoma.NatGenet.

2011Apr15.[Epubaheadofprint]2、JanelO.Johnson,J.RaphaelGibbs,etal.ExomeSequencinginBrown-Vialetto-VanLaereSyndrome.AmJHumGenet.

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2010Oct15;19(R2):R145-51.Epub2010Aug12.4、LeyTJ,MardisER,DingL,etal.DNAsequencingofacytogeneticallynormalacutemyeloidleukaemiagenome.Nature2008;456(7218):66-725、GnirkeA,MelnikovA,MaguireJ,etal.Solutionhybridselectionwithultra-longoligonucleotidesformassivelyparalleltargetedsequencing.NatBiotechnology2009;27(2):182-9.6、MurimChoia,UteI.Scholla,WeizhenJia,etal.(2010)GeneticdiagnosisbywholeexomecaptureandmassivelyparallelDNAsequencing.

PNAS.106:19096-19101.7、SarahBNg,KatiJBuckingham,CholiLee,etal.(2010)Exomesequencingidentifiesthecauseofamendeliandisorder.

NatureGenetics

42,30-35.50人类外显子组捕获测序案例WeiX,

WaliaV,

etal.ExomesequencingidentifiesGRIN2Aasfrequentlymutatedinmelanoma.NatGenet.

2011Apr15.[Epubaheadofprint]

黑色素瘤发生率一直在上升，此研究对黑色素瘤细胞进行外显子组捕获测序，发现了和其相关的高频突变基因。七个新发现的非同义高频突变位点单个基因中突变位点分析基因GRIN2A模式图，箭头表示突变位点转录组测序简介转录组即特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，包括mRNA和非编码RNA(Non-coding

RNA)。

第二代测序系统可精确检测单个碱基，并且不受到研究中先验信息的干扰，科研人员能够快速地获得某一物种特定器官或组织在某一状态下几乎所有mRNA转录本序列，从而能够开展：UTRs区域界定、可变剪切研究、低丰度新转录本发现、融合基因鉴定、cSNP（编码序列单核苷酸多态性）研究等。转录组测序测序流程全转录组总RNApolyT富集mRNA去除rRNANon-codingRNA转录组mRNARNA片段化、纯化、检测产量连接两端接头序列逆转录生成cDNA选择适当长度cDNA进行扩增纯化扩增产物，评估产量上机进行高通量测序转录组测序测序流程无参考序列测序流程有参考序列测序流程转录组主要分析内容无参考序列转录组分析内容有参考序列转录组分析内容1测序数据产量统计，数据成分和质量评估；2Contig及Scaffold长度分布3Unigene的长度分布和功能注释，GO分类，Pathway分析，差异表达分析4蛋白功能预测与分类，差异表达基因GO富集和Pathway富集分析。1基本数据统计，比对参考序列2序列在基因组上在分布3测序深度分析、随机性评估和基因差异表达分析4新基因预测，基因可变剪接鉴定和基因融合鉴定等。ReferencesMaherCA,Kumar-SinhaC,

CaoX,etal.Transcriptomesequencingtodetectgenefusionsincancer.Nature,2009Mar5;458(7234):97-101.GuojieZhang,GuangwuGuo,XuedaHu,etal.DeepRNAsequencingatsinglebase-pairresolutionrevealshighcomplexityofthericetranscriptome.GenomeRes.

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Transcriptome-guidedcharacterizationofgenomicrearrangementsinabreastcancercellline.

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IrvingH,etal.AdenovoexpressionprofilingofAnophelesfunestus,malariavectorinAfrica,using454pyrosequencing.PLoSOne.

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CrawfordJE,GuelbeogoWM,SanouA,TraoréA,VernickKD,etal.(2010)

DeNovoTranscriptomeSequencingin

Anophelesfunestus

UsingIlluminaRNA-SeqTechnology.PLoSONE5(12):e14202.doi:10.1371/journal.pone.0014202有参考序列转录组测序案例MaherCA,Kumar-SinhaC,

CaoX,etal.Transcriptomesequencingtodetectgenefusionsincancer.Nature,2009Mar5;458(7234):97-101.此研究使用454和Solexa两种高通量测序平台对前列腺癌细胞系VcaP和LNCaP转录组进行测序，以检测和研究前列腺癌细胞系中基因融合表达情况。基因融合分析基因嵌合分析流程MIPOL1-DGKB

基因融合模式无参考序列转录组测序案例CrawfordJE,GuelbeogoWM,SanouA,TraoréA,VernickKD,etal.(2010)

DeNovoTranscriptomeSequencingin

Anophelesfunestus

UsingIlluminaRNA-SeqTechnology.PLoSONE5(12):e14202.doi:10.1371/journal.pone.0014202此研究通过对3个按蚊样品进行高通量测序，通过拼接组装后，和相近物种进行比较基因组学分析。Denovo序列拼接、组装和比对流程拼接结果统计拼接和变异检测分析流程图比较基因组分析各类功能基因中氨基酸在物种间差异比例差异同源蛋白GO分类进化关系分析电子表达谱测序对特定处理条件下的全基因组基因表达谱进行分析，已被广泛用于功能基因组学和医学等研究领域。电子表达谱测序（DigitalGeneExpression,DGE）又称为基因表达标签测序（mRNAtagprofiling），其原理是通过两种酶切作用对基因中一段长度为21nt的序列标签进行测序。由于其测序只针对表达的基因进行测序，产生的数据量相对较小，是研究基因表达谱的经济而快速的研究手段。又称Tag-SAGE电子表达谱测序流程图NlaIII限制性酶切电子表达谱分析内容图像识别与原始碱基数据读取。去污染、去接头，标签序列计数统计。基因组比对与统计，基因序列比对获得所表达的基因列表基因差异表达分析。聚类与表达类型分析。GO基因富集与分类分析。Pathway富集与分类分析。蛋白相互作用网络分析。反义链转录本与新转录本检测。ReferencesMorrissyAS,etal.Next-generationtagsequencingforcancergeneexpressionprofiling.GenomeRes.2009.19(10):1825-1835.'tHoenPA,etal.Deepsequencing-basedexpressionanalysisshowsmajoradvancesinrobustness,resolutionandinter-labportabilityoverfivemicroarrayplatforms.NucleicAcidsRes,2008.36(21):e141(1-11).style7">3.HegedusZ,etal.Deepsequencingofthezebrafishtranscriptomeresponsetomycobacteriuminfection.MolImmunol,2009.46(15):2918-2930.AudicSandClaverieJM.Thesignificanceofdigitalgeneexpressionprofiles.GenomeRes.1997.7(10):986-995.ZhenhuaJeremyWu,

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1024-1039PeterRuzanovandDonaldL.Riddle.DeepSAGEanalysisoftheCaenorhabditiseleganstranscriptome.NucleicAcidsResearch,2010,Vol.38,No.10SaurabhSaha,AndrewB.Sparks,CarloRago,etal.Usingthetranscriptometoannotatethegenome.NatureBiotechnology

(2002)20,508-512电子表达谱测序案例分析MorrissyAS,etal.Next-generationtagsequencingforcancergeneexpressionprofiling.GenomeRes.2009.19(10):1825-1835.此研究用高通量电子表达谱测序（Tag-SAGE）和传统LongSAGE测序方法对癌症细胞进行研究，比较两种方法效果，揭示了电子表达谱在基因发现中的诸多优势，可发现更多的基因，减少GC偏好。两种方法所检测到的基因数比较GC偏好性和低丰度转录本检测效果小RNA测序小RNA是指长度在21-31nt的内源性非蛋白质编码RNA，广泛存在于高等和低等生物体内，其对mRNA的转录及转录后水平等生命过程起到调节作用。现已知小RNA可归纳成三类：微RNA(miRNA)，小干扰RNA(siRNA)和与piwi相互作用的RNA(piRNA)。miRNA长度为21~24nt，产生于有典型茎环二级结构的原转录本(pri-miRNA)，在动植物的目标mRNA的降解与抑制方面发挥重要作用。siRNA，长度在19