木素降解酶在纸浆中的生物技术漂浮

木素降解酶在纸浆中的生物技术漂浮

随着人类环保和生态意识的增强，环境对有害、致残和异常的有机氯化物，尤其是具有有机二氯酯气味的化合物的限制越来越严格。在国际范围内,对无元素氯和全无氯漂白的研究迅速展开。生物技术漂白将成为上述两种漂白的重点研究对象。利用微生物或其分泌的酶与纸浆作用,达到脱木素或有利于脱木素,并提高纸浆白度或改善纸浆可漂性的过程称为生物漂白。然而,直接用活体微生物处理原料或纸浆存在作用周期长、易生长杂菌等问题,不利于进行大规模的工业化应用。近年来,直接用木素降解酶,包括木素过氧化物酶(Ligninperoxidase)、锰过氧化物酶(Manganesedependentperoxidase)和漆酶(laccase),对纸浆进行漂白。随后,通过高产菌株的大规模发酵便可获得大量的漆酶,如真菌pycnoporuscinnabrinus发酵产漆酶,Lomascolo等利用菌株高产漆酶,使漆酶成为上述3种木素降解酶中最具工业应用价值的酶。漆酶是通过催化单电子氧化被取代的苯酚、苯胺和芳香硫醇等低氧化还原电势的化合物成它们所对应的自由基,并伴随将氧气还原成水的一类含多种铜离子的氧化酶。与具有大于1V氧化还原电势的木素过氧化物酶相比,低氧化还原电势(0.5～0.8V)的漆酶仅能直接氧化降解具低氧化还原电势的酚型木素结构单元。而占木素总量中绝大部分的非酚型木素结构单元则不能被氧化。Bourbonnais等和Call等发现了对漆酶漂白起到较好催化效率的人工合成介体,使漆酶可以氧化非酚型木素等本身不能直接被氧化的底物。但是,由于这些人工合成的介体市场价格昂贵及难确保其本身或其衍生物不具有毒性等缺陷,漆酶-介体体系仍未应用于工业生产,仅由Call在1994年进行中试试验。应用白腐菌氧化木素所产生的衍生物或微生物的代谢产物作为漆酶漂白的天然介体,具有环境和生态的优势。Camarero等发现,桉木硫酸盐浆黑液中含有的部分小分子酚类化合物具有与HBT(1-羟基苯并三唑)相当的催化漆酶的活性。本文综述了应用于漆酶漂白介体的最新研究进展,包括从黑液中分离和鉴定天然的漆酶介体,并将之与人工合成介体催化漆酶对染料的脱色、去除亲脂性抽出物的能力及对纸浆漂白的潜能进行比较。1漆酶介质体系中酶ca件的科学研究1.1电子受体的形成介体及漆酶的底物反应式可表述为:2底物—H2+O2−→漆酶−介体2Η2+Ο2→漆酶-介体2底物(ox)+2H2O即漆酶首先从氧化还原电势低的介体中获得电子,将介体氧化;介体便成为氧化还原电势较高、稳定的中间体,而此时的酶便以另一中间体的形式存在。之后,酶形成的中间体又将电子传递给氧气,氧获得电子和氢质子后便转化为水,成为最终的电子受体。漆酶形成的中间体失去电子后便重新恢复活性。而被氧化形成具有高氧化还原电势的介体自由基则进攻木素单元,从木素中获得电子,使木素氧化降解。而介体形成的中间体在获得电子后也重新回到其最原始的状态。这样的过程构成了一个催化的氧化还原循环体系,其假设的反应步骤见图1。1.2非酚型木素的合成及应用由于小分子介体克服了漆酶应用于漂白所具有的低氧化还原电势和蛋白质大分子进攻木素所形成较大空间位阻的障碍,目前的研究主要集中在探明LMS(Laccse-Mediator-System)氧化非酚型木素的机制;寻找稳定、高效、低毒和价廉的新介体,并将这些介体应用于催化漆酶的生物漂白。然而,介体的发现到广泛应用是一个漫长的过程,从人们猜想其天然介体的存在,到人工合成,再到从黑液中寻找生态和环境友好型的天然介体。其发展阶段见表1。2有机物主要被其降解原料成分中除了纤维素、半纤维素外,占主要部分的便是木素。化学法制浆将大量木素氧化降解并转移到黑液中,而包括木素在内的所有有机物又在黑液碱回收过程中转化为热能。但被降解的部分木素小分子仍然有可能吸附于浆料上,将增加后续漂白的化学品用量。如果能有效的分离这些小分子,并将其转化为高附加值产品,既可充分利用生物质资源,又可降低化学品消耗。进一步说,从黑液中分离小分子酚类化合物作为漆酶漂白的天然介体,不仅有效的利用了黑液,也有利于促进LMS生物漂白的工业化进程。2.1有机相的制备事实上,丁香醛和乙酰丁香酮等具有较高漆酶催化效率的介体,不仅是白腐菌等微生物或漆酶的主要降解产物,也是化学品(主要是碱)对富含丁香基型木素降解的主要产物。所以,下面仅介绍从桉木硫酸盐浆黑液和非木材碱法浆黑液中分离小分子酚类化合物的方法。从桉木硫酸盐浆黑液中分离小分子酚类物质:方法1:黑液→蒸馏水,体积比1∶1稀释→质量分数20%的H2SO4调pH值为2→离心,取液体→用体积比为1∶1的乙醚萃取24h,取有机相→用体积比1∶1的质量分数3%NaHCO3萃取24h,取有机相→加体积比1∶1NaOH萃取,取水相→质量分数10%盐酸调pH值为2→乙醚萃取,取有机相→蒸发浓缩→小分子酚类物质。方法2:黑液→蒸馏水,体积比1∶1稀释→质量分数20%的H2SO4调pH值为2→过滤,滤渣干燥后用适量乙醚萃取,收集有机相;滤液用体积比1∶1乙醚萃取,收集有机相→水相用体积比1∶1的乙酸乙酯萃取,收集有机相→混合3种有机相,蒸发浓缩→小分子酚类物质。从蔗渣碱法浆黑液中分离小分子酚类物质:方法3:黑液→过滤→加稀盐酸调pH值到9～9.5,悬浮液用体积比1∶1的乙醚萃取14天→收集有机相,水相用体积比1∶1的CHCl3萃取14天,收集有机相→混合有机相,加MgSO4干燥,蒸发浓缩小分子酚类物质。2.2基本组分测定将从桉木硫酸盐浆黑液中分离的小分子酚类物质进行GC-MS分析,见图2,其物质鉴定如表2。另外两种分离方法所得主要组分与方法1基本相同。从图2可以看出,此组分中丁香醇、丁香醛、丁香酮和丁香树脂占绝大部分。Camarero等利用购买的丁香醛、乙酰丁香酮等和HBT作为漆酶的介体对纸浆进行漂白,证明丁香醛、乙酰丁香酮具有与HBT稍差的酶催化功效,而其用量仅为HBT的50%,说明从黑液中分离小分子酚类物质作为漆酶漂白的介体是可行的。3利用不同的天然介体对酸性蓝773号脱色效果的影响自1994年,Call等用LEQP(L,木素酶漂白;E,碱抽提;Q,螯合处理;P,过氧化氢漂白)和LELEQP两种新的漂序代替工业上原有的OZEP(O,氧脱木素;Z,臭氧漂白)漂白流程,对两种不同的浆料进行中试试验,并取得单段脱木素率可大于50%、介体用量可缩减至0.6%的效果。LMS生物漂白便迅速成为国际上的研究热点。然而,由于催化效率较高的HBT等人工介体本身具有成本高和毒性等不利因素,到目前为止,包含LMS在内的TCF漂白流程仍未实现工业化应用。近期,已有文献介绍用木素小分子酚类衍生物作为LMS中酶催化的天然介体,应用于染料的脱色、去除纸浆中亲脂类抽出物和纸浆的漂白等方面,并取得较好的效果。Camarero等首次用木素小分子酚类衍生物作为漆酶的天然介体,对不同染料进行脱色。图3为相同条件下,漆酶-天然介体体系和漆酶-人工介体体系对酸性蓝74号脱色效果的比较。实验表明,两种紫丁香基型木素衍生物(丁香醛和丁香酮)被漆酶氧化的速率比愈创木酚型木素衍生物快50～100倍。同时,也是包括人工介体在内的所有介体中催化效率最快,脱色效果最好的漆酶介体。但相比之下,没有介体存在时,漆酶基本没有脱色能力。因为低氧化还原潜能的漆酶根本不能氧化具高氧化还原电势的染料。Ana等用漆酶-天然介体体系与桉木硫酸盐未漂浆作用,接着进行H2O2漂白,仅谷甾醇和豆甾烷醇没有完全处理掉。而未经漆酶-介体体系处理或用HBT作为漆酶介体进行处理后的纸浆抽出物中仍然有大量的亲脂性物质存在。结果见图4。从图4A中可知,仅仅用H2O2处理纸浆,大量甾醇类亲脂性物质无法除去;从图4B中可知,利用漆酶-HBT体系进行处理,然后再用H2O2处理,甾族碳水化合物基本被除去,豆甾醇和豆甾烷醇含量大大减少,谷甾醇酯和谷甾醇-3β-D-吡喃葡萄糖苷都被除去;从图4C中可知,虽然豆甾醇和豆甾烷醇没有被完全除去,但浆料中二者的含量大大减少,其他亲脂类物质都被除去。最近,Camarero等利用从P.cinnabarinus中获得并经纯化的漆酶,在木素小分子酚类衍生物作为天然介体及氧气存在的条件下,对桉木硫酸盐浆进行漂白,卡伯值由14降至10左右,白度由41%增至67%左右,结果见图5。上述实验表明,LMS在合适的天然介体存在下,有显著的脱木素和提高纸浆白度的作用。虽然丁香醛和丁香酮的催化效果比HBT稍差,但具有价廉、用量少和无毒等经济、环保的特性,使LMS生物漂白更有潜在的应用前景。4非酚型木素类衍生物随着真菌漆酶的可大规模发酵生产及HBT等高效催化介体的出现,特别是Call进行LMS生物漂白的中试试验,解决了