一株甲醛耐药真菌的分离与培养

一株甲醛耐药真菌的分离与培养

甲醛是一种广泛使用的重要化工原材料，但它往往导致环境污染，对人们的健康和健康构成威胁。室内空气甲醛污染主要来自家具和装修用的各种人造板材,它易发生加成、氧化、还原、聚合反应,有高度的水溶性和与生物大分子的高度反应性,甲醛在接触部位吸收或降解,进入人体后,主要与人体的蛋白质和核酸反应,损害DNA,引起细胞核的基因突变、DNA单链内交连、DNA与蛋白质交连、抑制DNA损伤的修复;与氨基结合,改变蛋白质的内部结构并凝固,扰乱人体细胞的正常代谢。它致畸、致癌,在我国有毒化学品优先控制的名单上居第2位。统计显示,中国每年有11万人死于与室内污染有关的疾病,北京儿童医院经过半年问诊调查发现:近90%的小儿白血患者家中近期都曾经装修过。人一生中约有80%的时间是在室内度过,因此找到甲醛污染防治对策刻不容缓,对人类健康意义重大。甲醛降解效果研究总的来说是一个从低浓度到高浓度过程,早期人们着手于低浓度甲醛降解的研究,近年来高浓度甲醛降解时有报道。Adroer等人分离了的P.putidaA2能降解甲醛250mg·L-1,Azachi等人分离了的Halomonassp.MAC能耐受甲醛7500mg·L-1,Doronina等人研究的P.alcaligenes能降解甲醛200mg·L-1,P.putidaJ3能降解甲醛450mg·L-1,M.extorquens能降解甲醛500~1000mg·L-1;一株P.alcaligenes培养3d后能降解甲醛2000mg·L-1,SaeedMirdamadi等人报道M.extorquens(ESS和PSS)和4株P.pseudoalcaligenes(LSW,SSW,NSW,OSS)能降解甲醛1850mg·L-1,其中P.pseudoalcaligenesOSS培养24h将3700mg·L-1甲醛100%消耗,培养72h消耗5920mg·L-1甲醛70%,M.extorquensESS和M.extorquensPSS还能完全降解甲醛2960mg·L-1。Bonastre报道在ρ甲醛为2300mg·dm-3的活性淤泥做基质的实验里能部分的降解甲醛,甲醛能在好氧条件下被好氧菌降解,PseudomonasputidaA2当以甲醛为碳源时降解甲醛400mg·dm-3,Zagornaya报道在活性淤泥厂的废水处理中完全降解甲醛2300mg·dm-3和苯酚2400mg·dm-3,Yamazaki等人从海水里分离了一株甲醛耐受细菌,发现它在3%的氯化钠里能降解甲醛400mg·dm-3,在MartaEiroa[12设计的模型里,指出硝化作用可以降解甲醛,当甲醛为碳源和甲醇为伴生碳源,硝化细菌可以降解甲醛的质量浓度是30~3890mg·dm-3,而反硝化细菌在有甲醛和甲醇存在时可以降解甲醛1360mg·dm-3。在真菌的研究方面,TetsuyaKondo等人从土壤中分离了一株甲醛耐受真菌(可以称甲醛降解菌)AspergillusnomiusIRI013,它能生长在最高w(甲醛)=0.45%里并把它完全消耗掉。甲醛降解微生物的研究在国内目前尚未见报道,国外甲醛降解真菌方面的研究报道也远远少于细菌、酵母菌等微生物,但作为微生物群体重要组成部分的真菌,其数量之庞大、种类之繁多仅次于细菌,因此应该还有大量的甲醛降解真菌不为人们所知,本文试图从真菌中来寻找甲醛降解菌,以期为甲醛污染防治作出一点贡献。1材料和方法1.1no3,0.1hpo4,5.2甲醛标准溶液分离基本培养基配方为(w/%):1.0葡萄糖,0.2NaNO3,0.1K2HPO4,0.05MgSO4·7H2O,0.05KCl,0.001FeSO4·7H2O,0.01酵母膏,0.1甲醛(甲醛用市售甲醛标准溶液),pH6.0。1.2培养基平板画线培养于家具厂无处理出水口处取淤泥样,在超净工作台上,取10g淤泥样置于90mL无菌水中,振荡15min,放置20s,取1mL上清液接种于培养液里,在摇床上160r·min-130℃培养5d,生长起来的真菌再多次用PDA培养基平板画线,直到分离到单菌落为止。1.3评估1.3.1培养基菌落特征观察选取察氏培养基、麦芽汁培养基、加孟加拉红的PDA培养基,将接种针经火焰灭菌并冷却后,蘸取极少量的孢子,点植于平板上的中间位置,将平板置于25℃培养8d,观察菌落的特征。1.3.2显微镜观察用解剖针从培养皿的菌落上,挑取少许菌体,置载玻片的水滴中,于显微镜下观察其形态特征。1.3.3系统成分分析DNA的提取参照CTAB法进行,DNA浓度和纯度的检测,采用核酸/蛋白分析仪于NucleicAcid程序下测定。PCR采用真菌18SrDNA扩增通用引物;上游引物F1:GATCCTGCCAGTAGTCATATGC,下游引物ITS2:GCTGCGTTCTTCATCGATGC,反应条件为94℃5min,94℃1min、56℃1min、72℃1min进行30个循环后,于72℃反应7min。用w=1.0%的琼脂糖凝胶电泳40min,于UVI凝胶成像系统分析结果。扩增产物测序由上海英俊生物技术有限公司完成,测序结果在Genbank数据库内进行同源序列搜索(blastsearch),找出该菌株与数据库中同源性最高的模式菌株。1.4减少二甲苯的能力1.4.1真菌生长曲线图选取产孢良好的真菌,接种在ρ(甲醛)=0.1%的基本培养基中,于摇床上160r·min-130℃培养8~9d,间隔测定A475值,并记录数据,作出真菌生长曲线图,观察进入快速生长的时间并记录。1.4.2生长活性的测定选取大口250mL三角瓶21个,配制液体培养基,ρ(甲醛)按约1100mg·L-1加入,瓶口用无菌封口培养膜封口(无菌封口培养膜是环凯公司生产的双层膜,上有直径0.6cm的圆孔两个,中间有直径3cm、孔径小于0.2µm的无菌滤纸片,多用于组培生产),培养刚进入对数生长期的真菌(A475值0.167),除空白外每瓶加入5mL,置摇床上160r·min-1培养,每天取3瓶用于测ρ(甲醛)和生长A值,其中一瓶为空白,两瓶加一级种子菌种5mL,共取7次,A值测定用北京普析通用仪器有限责任公司TU-1800型紫外可见分光光度计,ρ(甲醛)用AHMT分光光度法检测,测ρ(甲醛)前先离心、过滤。2结果与分析2.1培养基和分生孢子囊在加了孟加拉红的PDA培养基上呈环状生长(图1),菌丝绿色,反面无色,直接镜检孢子着生成葡萄状(图4);在察氏培养基上生长8d,直径可达52mm,平薄,粗糙或稍呈颗粒状,最外缘为白色,内部为黄色,后期稍呈绿色,干燥无渗出液,表面无辐射状纹,反面蛋壳黄色,基质有不规则的辐射皱折沟纹(图2);在麦芽汁培养基上菌丝生长旺盛,呈棉絮状,较厚,产孢后呈橄榄绿色,接种点附近下沉,呈圆形围湖沟,有同心环状,无渗出液,无辐射纹,反面淡黄色,有辐射皱折沟纹(图3)。镜检分生孢子囊初为球形,后呈辐射状,200~500µm,或裂成几个疏松的柱状体,分生孢子梗大多自基质伸出,壁厚,粗糙;顶囊近球形,直径23~50µm,大部分表面可育,产孢结构双层,也有单双层者;分生孢子球形,直径2.4~4.1mm,壁稍粗糙(图5)。2.2srdna序列该甲醛降解真菌的18SrDNA序列与黄曲霉(Aspergillusflavus)同源率达99.8%,18SrDNA序列长度为1661bp。2.3减少二甲苯的能力2.3.1接种后8h的稳定性本实验通过定时测定真菌在190h内的A值,可以看出真菌在pH5.0~6.0都能很好的生长,在接种孢子后的33~48h开始进入快速生长期,在144h逐渐转入平衡生长期。在pH5.5中,虽然接种后0hA值为0.014,比pH6.0要低(pH6.0A值为0.021),但在33h以后A值就明显高于pH6.0和pH5.5,48~144h为快速生长期,pH5.5的A值也一直高于其余两个(图6)。本结果证明该真菌最适pH值为5.5,以下的实验培养基pH值即调整到pH5.5。2.3.2平行误差小空白值的结果变化不大,也就说明大约1100mg·L-1甲醛水溶液挥发不大,仅在144h时ρ(甲醛)有下降的趋势,该真菌在144h消耗甲醛量约1237mg·L-1,平行误差小,没有出现较大的波动。在培养的96h内ρ(甲醛)下降迅速,A值上升缓慢,培养到120h时ρ(甲醛)为10mg·L-1时,真菌A值从0.210、0.225快速上升到144h时的0.862、0.857,进入快速生长期,甲醛下降速度减缓(表1和下页表2),原因可能是前期高浓度的甲醛抑制真菌生长,A值上升缓慢,真菌利用甲醛和葡萄糖同时为碳源,当ρ(甲醛)下降到10mg·L-1时,甲醛也不足以抑制真菌的生长,真菌繁殖迅速,A值快速上升,真菌优先利用葡萄糖,ρ(甲醛)下降缓慢。3分生孢子及其降解甲醛的特性该甲醛降解真菌能在甲醛培养基里生长,且能将高ρ(甲醛)为1241mg·L-1在培养144h内降解到10mg·L-1以下。在加了孟加拉红的PDA培养基上呈环状生长,菌丝绿色,反面无色(图1),直接镜检孢子着生成葡萄状(图4);在察氏培养基上生长8d,直径可达52mm(图2);在麦芽汁培养基上菌丝生长旺盛,呈棉絮状,产孢后呈橄榄绿色,接种点附近下沉,呈圆形围湖沟,有同心环状,无渗出液,无辐射纹,反面淡黄色,有辐射皱折沟纹(图3)。镜检分生孢子囊初为球形,分生孢子梗大多自基质伸出,壁厚,粗糙,分生孢子球形,直径2.4~4.1mm(图5),其18SrDNA序列分析与黄曲霉(Aspergillusflavus)同源率达99.8%,我们把该真菌命名为AspergillusflavusH4。它最适pH值为pH5.5(见图6),能降解甲醛,该真菌在144h消耗甲醛量约1237mg·L-1,平行误差小,在培养的96h内ρ(甲醛)下降迅速,A值上升缓慢,培养到120hρ(甲醛)为10mg·L-1时,真菌A值从0.210、0.225快速上升到0.862、0.857,进入快速生长期,甲醛下降速度减缓。AspergillusflavusH4是甲醛降解菌。4菌株、培养基和真菌的生长近年来微生物的多种甲醛解毒系统均有报道,比如甲醛固定酶,己酮糖磷酸合成酶(HPS)和己酮糖磷酸异构酶(PHI),也属于解毒系统,主要是甲基细菌含有,耐热的甲基菌BacillusbrevisS1的HPS和PHI基因表达3-己酮糖-6-磷酸酶和6-己-3-磷酸酶,磷酸核酮糖路径操纵子编码甲醛固定。Methylobacteriumsp.MF1是能有效降解甲醛并把它作为碳源的甲基细菌,该菌能生长在多种碳源的培养基上,也能生长在只有甲醛为碳源的培养基上。当培养基使用1.2g·L-1的甲醛作为碳源时,甲醛在200h内全部被消耗完,在有甲醇和甲醛的恒化培养器中分批加料培养时,甲醛也能被有效的消耗。Methylobacteriumsp.MF1先利用甲醇作为碳源并吸收甲醛,通过甲醇脱氢酶形成代谢媒介,甲醛被甲醛脱氢酶以NAD+为辅酶、谷胱甘肽存在的条件下被代谢掉或吸收。近年来先后报道非甲基细菌也有HPS和PHI,Bacillussubtilis在与甲醛接触之后HPS和PHI也得到表达。MethylobacteriumextorquensAM1的转移/水解联合酶(Fhc)可将甲醇和甲醛氧化成CO2,产生甲酸