维生素d没有小鼠模型性激素改变对肾精不足小鼠模型的影响

维生素d没有小鼠模型性激素改变对肾精不足小鼠模型的影响

中医藏象论认为，肾藏精是先天之本。肾控制组织的主要成员，负责生长、发育和生殖。肾主水,与冬季相应。然而对“肾藏精”物质基础尚未揭示,随着维生素D生物作用的广泛研究,本课题组前期文献研究提出维生素D为“肾藏精”物质基础。现以维生素D缺乏小鼠模型性激素改变探讨其作为肾精亏虚模型的可行性,为临床研究“肾精不足”提供理论支持及动物模型。动物饲养管理3周龄清洁级雄性昆明小鼠40只,体质量(18±2.0)g,普通饲料均购自重庆中药研究院实验动物研究所,动物许可证:SCXK(渝)2007-0006,检疫合格证号:0003854。99.9%氯化锶,天津博迪科技有限公司,批号:20081125;氢化可的松注射液,天津金耀氨基酸有限公司,批号:809021。将40只小鼠随机分为正常对照组、肾阳虚组、肾阴虚组及维生素D缺乏组(VD缺乏组),每组各10只。参照文献,肾阳虚组给予氢化可的松25mg/kg,皮下注射10d、肾阴虚组给予氢化可的松50mg/kg,皮下注射5d。正常对照组给予等量0.9%氯化钠溶液皮下注射。小鼠普通饲料喂养,自来水自由饮用。维生素D缺乏组普通饲料喂养,用含2.5%氯化锶的自来水自由饮用,同时饲养笼周围用不通光帘布避光。每日12h正常光照。保持饲养环境通风,同时避免紫外灯光照射。观察小鼠的生活行为改变。饲养6周,称重后,戊巴比妥腹腔麻醉,腹股沟取血,分离血清,-20℃冰箱保存。25(OH)D3(VD,批号:DZE20469),睾酮(T,批号:DZE20268),雌二醇(E2,批号:DZE20359),黄体生成素(LH,批号:DZE20587),以上均为酶免检测试剂盒(R&D公司生产)购自北京永慧信达科技发展有限公司。严格按试剂盒提供方法操作,在BiotekSynergyTM2型分光光度计测量OD值,波长450nm,根据标准品对照进行直线回归方程,计算各指标浓度。计量资料均以表示,应用SPSS18.0统计包进行数据分析,两两比较采用配对t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。肾阳虚对小鼠血清25oh3d、t、e、lh的影响VD缺乏组小鼠在造模20d左右出现行动迟缓,背部拱曲,皮毛逐渐散乱,皮毛光泽度较正常对照组变暗。见表1。VD缺乏组小鼠血清25(OH)D3、T、E2含量较正常对照组小鼠明显降低(P<0.05),LH降低,但差异无统计学意义。与VD缺乏组比较,肾阳虚组、肾阴虚组血清25(OH)D3、T、E2、LH明显升高(P<0.05)。VD缺乏模型T、E2、LH与维生素D水平正相关。维生素d的功能20世纪50年代,沈自尹教授开展肾本质研究,对肾虚证研究取得不少成果。但随着研究的深入,也带来了不少困惑与迷惘。特别是肾虚模型不能完全体现中医“肾”藏象的内涵。肾虚相关疾病如女性更年期综合征患者,雌激素并不能很好的解释其与心血管疾病风险间的关系,同时中药对症治疗后患者的症状明显改善,但与其伴随的却不是性激素水平的变化,这一现象没能得到很好的解释。国内很多学者试图找出肾虚的物质基础,目前尚未得到大家公认的“金指标”。肾虚骨质疏松模型出现维生素D的缺乏,但未见维生素D缺乏模型与肾虚证相关研究,笔者初步以维生素D缺乏小鼠性激素改变,探讨维生素D缺乏肾精不足模型的可行性。肾本质研究必须体现中医藏象理论的固有特点。早在2000多年前,《黄帝内经》就提到“肾藏象”的表现:“女子七岁,肾气盛,齿更发长;二七而天癸至,任脉通,太冲脉盛,月事以时下,故有子;三七,肾气平均,故真牙生而长极;四七,筋骨坚,发长极,身体盛壮;五七,阳明脉衰,面始焦,发始堕;六七,三阳脉衰于上,面皆焦,发始白;七七,任脉虚,太冲脉衰少,天癸竭,地道不通,故形坏而无子也。丈夫八岁,肾气实,发长齿更;二八,肾气盛,天癸至,精气溢写,阴阳和,故能有子;三八,肾气平均,筋骨劲强,故真牙生而长极;四八,筋骨隆盛,肌肉满壮;五八,肾气衰,发堕齿槁;六八,阳气衰竭于上,面焦,发鬓颁白;七八,肝气衰,筋不能动,天癸竭,精少,肾藏衰,形体皆极;八八,则齿发去。肾者主水,受五藏六府之精而藏之,故五藏盛,乃能泻”(《素问·上古天真论》)。指出肾藏精,主骨,主生长、发育、生殖,伴随着人的生、长、壮、老、已的生命过程。同时把肾与冬季、北方等结合起来,形成一个完整的肾藏象调节过程。本课题组前期从文献角度探讨,认为维生素D可以承担肾藏象的物质基础,提出维生素D为肾藏精的物质基础。现代研究表明维生素D伴随着人体生长、发育、生殖、衰老的整个过程。维生素D来源于皮肤的合成及食物的摄入。皮肤合成及食物摄入的无活性的维生素D前体,经肝微粒体中25羟化酶形成25(OH)D3,25(OH)D3再经过肾线粒体1α,25羟化酶作用,形成具有生物活性的1,25(OH)2D3,1,25(OH)D3作用于维生素D受体(VDR),除调节钙磷代谢外,发挥广泛的生理作用。肾及肾外部分组织表达24羟化酶,促进1,25(OH)2D3分解为无活性的24,25(OH)2D3。1α,25羟化酶及24羟化酶在维生素D代谢平衡中发挥重要作用。VDR敲除小鼠表现生殖能力减退、生长发育迟缓、脱发、骨骼发育异常、对病原体的易感性。肌肉功能障碍,运动能力降低等。与中医肾精不足临床表现具有一定的相似性。同时维生素D缺乏与心脑血管病、肿瘤、免疫性疾病发生发展具有密切的相关相关性。维生素D缺乏除导致骨骼发育不良外,还导致肾素-血管紧张素系统激活,呼吸道上皮异常等。维生素D的季节波动与冬季流行感冒的爆发流行有一定相关性。这与肾应冬及“冬不藏精,春必病温”具有一定的关联性。为此笔者制作维生素D缺乏肾精不足模型,探讨其性激素变化。氯化锶为一种水溶性物质,低浓度的氯化锶促进钙吸收,高浓度氯化锶(2.5%-4%)抑制25(OH)2D3合成,减弱肠道对钙的吸收,损害骨矿化,导致导致骨骼发育障碍,形成“锶软骨病”。笔者选用在饮用水中加入2.5%的氯化锶,通过干扰食物的摄取及不透光布遮盖,避免紫外线照射,从两个方面造成小鼠体内25(OH)D3缺乏,是造成本模型的关键所在。实验结果显示6周后小鼠血清25(OH)D3水平下降,符合维生素缺乏模型。同时观察到小鼠表现为行动迟缓,皮毛散乱,可能为维生素缺乏导致钙磷代谢紊乱、骨骼发育不全、肌肉功能障碍,肌肉肌力减弱,运动能力降低所致。维生素D缺乏组、肾阳虚组、肾阴虚组与正常组比较均表现维生素D、睾酮降低。肾阳虚组、肾阴虚组与正常组比较,雌二醇、黄体生成素水平升高。维生素D缺乏组与正常组比较雌二醇、黄体生成素降低。维生素D缺乏模型、肾阳虚组、肾阴虚组均表现性激素分泌的紊乱,维生素D缺乏组性激素改变与维生素D改变具有一致性。维生素D缺乏组、肾阳虚组、肾阴虚组与现代研究性激素代谢紊乱是肾虚的一个指标相吻合。笔者初步运用理化因素造成25(OH)D3缺乏模型与已有的模型比较,从性激素方面模拟肾虚证侯具有较高相似性。本模型制作方法具有相对简便,周期短,成功率高,成本低,重复性较好等特点。但作为肾精不足模型,有待进一步探讨其与肾主骨生髓、主水功能的关系以及结合现代较为认可的下丘脑-垂体-肾上腺、