姜黄素对糖尿病大鼠肾组织opnnf-b信号途径的影响

姜黄素对糖尿病大鼠肾组织opnnf-b信号途径的影响

糖尿病性肾衰竭（dn）是糖尿病（失真期）中常见的微血管并发症之一。在中国和西方国家，dn是肾衰竭的主要原因。我们必须有效地研究其发病机制和治疗方法。目前,氧化应激-炎症-氧化应激这一恶性循环被认为是DM相关血管并发症的主要病因。研究证实,转录因子核因子κB(NF-κB)的激活在各种慢性炎症疾病包括肾脏疾病中都发挥关键作用,其中p65亚单位具有转录活性。骨桥蛋白(OPN)是一种多功能的分泌性糖蛋白,广泛存在于正常成人组织和体液中,在骨骼矿化、细胞迁移转化、慢性炎症疾病以及肿瘤的发生转移中都发挥作用。在炎症疾病中,OPN既能作为趋化因子调节单核-巨噬细胞的聚集,又能刺激NF-κB/p65亚单位的核转导激活而发挥间接致炎作用。姜黄素是调味品姜黄的主要成分,是一种植物多酚,具有广泛的生物活性,如抗炎、抗氧化、抗癌、抗动脉粥样硬化、抗诱变,促进免疫调节和抗肾纤维化作用。本实验构建2型糖尿病大鼠模型,通过姜黄素给药干预,观察姜黄素对大鼠肾组织形态学变化以及单核-巨噬细胞浸润的影响,主要是通过观察对OPN/NF-κB途径的影响来初步探讨其对DN的治疗作用机制,为临床应用提供理论依据。1材料和方法1.1免疫、筛选和pcr检测姜黄素(上海国药集团化学试剂有限公司,纯度99%,批号:823-9401)。链尿佐菌素(STZ,美国Sigma公司,批号:HO250),以0.1mol·L-1、pH值为4.2枸橼酸缓冲液稀释。Trizol(美国Invitrogen公司),RT-PCR相关试剂(日本TOYOBO公司),兔抗大鼠NF-κB/p65多克隆抗体、兔抗大鼠CD68单克隆抗体、过氧化物酶标记羊抗兔(二抗)、过氧化物酶标记的链霉卵白素(SP)染色试剂盒均购于北京中山生物技术有限公司。胰岛素放射免疫分析药盒(50管)购于北京北方生物技术研究所。1.2仪器、仪器和检测方法血糖仪及血糖试纸(德国罗氏公司),SN-682放射免疫γ计数器(中国科学院上海原子核研究所),自动生化分析仪(美国Technicon公司),Olympus-BX60光学显微镜(日本Olympus公司),病理摄像及图像分析系统(华中科技大学同济医学院千屏影像工程公司),梯度PCR仪(型号TGRADIENT,德国Whatman/Biometra公司)。1.3方法1.3.1造模大鼠的确定40只清洁级雄性SD大鼠,体质量200～250g(华中科技大学同济医学院实验动物中心提供)。随机分成假手术组(S组,8只)及手术组(32只)。S组大鼠只剥离左侧肾包膜不切肾,手术组切除左侧肾脏。术后2周手术组大鼠随机分为单切肾脏组(1/2Nx组,8只)及实验组(24只)。实验组大鼠用于造模,模型制备方法参考文献,并作适当改进。具体方法如下:大鼠行左侧肾切除2周后,经高脂高糖饮食(常规饮食加20%蔗糖、10%猪油、2.5%胆固醇)诱导4周后,分2次小剂量腹腔注射链尿佐菌素(30mg·kg-1),间隔1周。S组及单切肾脏组仅予等量枸橼酸缓冲液腹腔注射。第2次注射2周后,所有实验大鼠均禁食12h取鼠尾血,测空腹血糖(FPG)及血清胰岛素水平(FINS),计算胰岛素敏感指数(ISI),ISI=Ln。将造模大鼠ISI小于或等于非造模大鼠均值及尿糖强阳性者选定为2型糖尿病大鼠(共16只),再将其随机分为2组,即糖尿病肾病组(DN组,8只)、姜黄素治疗组(DN加Cur组,8只)。确定成模后第2天,姜黄素治疗组以姜黄素(200mg·kg-1·d-1)灌胃,其余3组同时每日以1%羧甲基纤维素钠灌胃。动物单笼饲养,自由进食饮水。1.3.2净水器复配给药第6周时用代谢笼收集大鼠24h尿液,计总量后离心,保存于-30℃冰箱。第6周末,将大鼠称取体质量并麻醉后行下腔静脉取血,立即游离右肾称质量,取部分皮质固定于4%多聚甲醛,其余皮质装入RNase-free冻存管中,并立即放入-80℃冰箱保存。1.3.3血心肌指标scr、尿胱日光检查用血糖仪测定血糖,胰岛素放免试剂盒测定血清胰岛素水平,全自动生化分析仪测定血肌酐(Scr)、尿肌酐(Ucr)、尿微量白蛋白(mAlb)。计算内生肌酐清除率(Ccr),Ccr=Ucr(μmol·L-1)×尿量(ml·min-1)/Scr(μmol·L-1)。1.4肾病理分析1.4.1系膜区密度检测肾皮质于4%多聚甲醛固定24h后常规石蜡包埋切片,行PAS染色,镜下观察其病理改变并用病理摄像及图像分析系统测定系膜区密度(系膜区面积/肾小球面积)。1.4.2/p65及cd65采用SP法,按试剂盒说明书操作步骤,行免疫组化染色检测肾组织中NF-κB/p65及CD68的表达情况。应用病理摄像及图像分析系统,每张免疫组化切片随机选取10个高倍视野(×400),分别计数每个肾小球视野内CD68(胞浆)、NF-κB/p65(胞核)阳性细胞数,最后以每组的均值进行比较。1.5opn引物与环境因子取-80℃冰箱保存的肾皮质,用Trizol试剂一步法提取总RNA,测定浓度及纯度,取总RNA约2μg逆转录合成cDNA,反应体积为20μl。取1.0μl逆转录产物进行PCR循环。引物采用PrimerPremier5.0设计,由上海英骏生物技术有限公司合成。OPN引物序列为:上游5′-AGAGAGCAACGGGAAGAC-3′,下游5′-ATGGAACTCGCCTGACTG-3′,扩增产物长度为207bp。内参GAPDH序列为:上游5′-TCCCTCAACATTGTCAGCAA-3′,下游5′-AGCTCCACAACGGATACATT-3′,扩增产物长度为300bp。扩增条件为:95℃预变性5min后进入94℃1min、55℃1min、72℃30s,循环33次,终末延伸72℃10min。反应结束后,PCR产物在Glodview染色的1%琼脂糖凝胶电泳后摄图,分析各组目的基因和GAPDH条带的灰度值,计算两者比值,并以此对目的基因的表达量进行半定量分析。1.6pss1.5统计学分析所有实验数据以x¯±s表示,用SPSS11.5软件进行方差齐性分析和组间t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。相关性采用直线相关分析。2结果2.1dn组血糖、尿malb、肾质量/体质量、ccr水平比较见表1。从表1可见,1/2Nx组各项指标与S组比较差异无统计学意义(P>0.05)。DN组血糖水平显著高于S组和1/2Nx组(P<0.01),但与DN加Cur组比较差异无统计学意义(P>0.05),DN组尿mAlb、肾质量/体质量、Ccr水平较S组明显增加(P<0.01);DN加Cur组上述指标均低于DN组(P<0.05)。2.2dn组和cur组cd65蛋白表达情况见表2。从表2可以看出,大鼠系膜区密度DN组显著高于S组和1/2Nx组(P<0.01),而S组与1/2Nx组间比较差异无统计学意义(P>0.05);DN加Cur组低于DN组(P<0.05)。DN组的CD68、NF-κB/p65表达水平均高于S组和1/2Nx组(P<0.01);DN加Cur组高于S组和1/2Nx组(P<0.05,P<0.01),但低于DN组(P<0.05)。从形态学上看,S组与1/2Nx组中几无单核-巨噬细胞(CD68),DN组、DN加Cur组肾小球CD68阳性细胞数明显增加,但DN加Cur组较DN组相对较少(图1A、B)。NF-κB/p65蛋白在S组与1/2Nx组仅极少部分肾小球细胞核中表达NF-κB,其p65亚单位主要位于胞浆中;在DN组中阳性颗粒呈团块状,且多于胞核内表达,DN加Cur组肾小球中核阳性细胞数较DN组明显减少(图1C、D)。2.3spe检测dn、opn表达各组大鼠肾组织中OPNmRNA均有不同程度的表达,见图2。对目的条带相对灰度值进行比较分析后显示,S组与1/2Nx组间比较差异无统计学意义(P>0.05);DN组和DN加Cur组与SHAM组、1/2Nx组比较,OPN表达均增强(P<0.01,P<0.05);与DN相比,DN加Cur组OPN表达减弱(P<0.05),结果见表3。2.4间有相关趋势,但相关性无统计学意义糖尿病组中,CD68阳性细胞数与OPNmRNA间有相关趋势,但相关性无统计学意义(P>0.05);p65核阳性细胞数与OPNmRNA表达显著相关,r值为0.7243(P<0.01)。3opn与nf-b核转导的关系单核-巨噬细胞浸润导致的局部微炎症状态是糖尿病肾病发病机制中一个重要环节。本实验结果显示,DN组CD68阳性细胞数较S组明显增多,而DN加Cur组显著减少(图1A、B),说明姜黄素通过抑制糖尿病肾组织中炎症细胞浸润来发挥对肾脏的保护作用。OPN是一种促炎症细胞因子,具有趋化单核-巨噬细胞浸润的作用。本实验结果显示,DN组OPNmRNA表达的上调与肾组织中单核-巨噬细胞的聚集并没有明显相关性,这说明OPN表达上调并不直接导致单核-巨噬细胞浸润。OPN还能促进肾脏血管平滑肌细胞生长、系膜细胞增生及胶原合成,DN患者体内OPN的血浆水平与DN进展呈一定相关性,这些都说明OPN与DN的进展有关。而姜黄素能下调糖尿病肾组织中OPNmRNA的表达(图2、表3),可部分削弱OPN促DN进展的作用。正常情况下,NF-κB二聚体绑定于抑制型的亚单位IκB,以一种非活性形式存在于胞浆中。一旦受到刺激,IκB激酶(IKK)使得IκB磷酸化,结果导致NF-κB二聚体转导至细胞核内,激活了靶基因的转录。本实验糖尿病大鼠肾组织中,p65阳性颗粒多位于胞核周围,p65核阳性细胞数显著增多,说明多数细胞NF-κB被激活(图1C、D)。相关分析发现,OPNmRNA表达与p65核阳性细胞数显著相关,这说明OPN能促进NF-κB的核转导激活。进一步的研究证实OPN与其受体β3整合素连接后可能通过激活PI3′激酶/Akt/IKK调节信号途径激活NF-κB。姜黄素显著减少NF