重组蛋白表达系统的选择

重组蛋白体现系统的选择、体现方略和办法学研究张宁1.前言在生命科学的诸多研究和应用领域中，如何获得大量、均一、高纯、有活性的蛋白质都是一种核心问题。当代重组蛋白体现技术为我们提供了多个选择：传统的大肠杆菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞体现系统以及较新的植物和体外体现系统。每种体现系统都有诸多成功的例子，但重组蛋白的个性不尽相似，没有任何一种系统和办法是普遍合用的，为目的蛋白选择一种恰当的体现系统也就成为体现工作的重中之重。有关目的蛋白的一切信息，对体现系统的选择都是有协助的，有几个最基本的问题一定要在体现之前回答清晰：目的蛋白的来源是原核还是真核生物含有什么样的功效分子量和聚合状态是膜蛋白还是水溶蛋白胞内体现还是分泌体现与否需要以及需要何种翻译后修饰有无配体、底物或产物类似物能够运用对蛋白酶与否敏感有多少分子内及分子间二硫键对目的蛋白的体现量、活性、体现速度和成本有如何的规定除了摸清目的蛋白的脾性，还要清晰各个体现系统的特点、优势和局限性，才干找到体现工作的大略方向，要获得最适合目的蛋白的体现方案，还需要在具体实验中调节优化。表1比较了现在惯用的体现系统的特点，并给出了粗略的合用范畴。大肠杆菌酵母昆虫细胞哺乳动物细胞流程简朴简朴复杂复杂培养基简朴简朴复杂复杂成本低低中高产率高中中低体现量高高较高较低蛋白折叠中较好较好好胞外体现周质空间分泌至培养基分泌至培养基分泌至培养基细胞增殖周期30min90min18H24H折叠常有错误折叠偶有不当折叠对的折叠对的二硫键难以形成有有有N-糖基化无甘露糖残基，高无唾液酸，简朴复杂O-糖基化无有有有磷酸化无有有有酰化无有有有γ-羧基化无无无有合用原核蛋白、简朴真核蛋白真核蛋白、分泌体现蛋白真核蛋白、分泌体现蛋白复杂高等真核生物蛋白表1：惯用体现系统比较 2.原核体现系统原核体现系统发展完善、流程简朴快速、成本低、产量高，对大部分蛋白来说都值得一试，特别适宜于体现原核来源的以及不需要翻译后修饰的真核蛋白。体现菌株原核体现系统刚用的宿主菌有E.coli，Bacillus等。其中革兰式阳性的Bacillus更适宜在其周质空间分泌体现重组蛋白；革兰氏阴性的E.coli能够广谱体现异源蛋白。大肠杆菌体现系统是现在发展最完善的重组蛋白体现系统。惯用大肠杆菌菌株有BL21（DE3）、BL21（DE3）Star、B834（DE3）等，这些菌株都敲除了蛋白酶，并溶源了噬菌体DE3。DE3是的一种衍生λ噬菌体，带有噬菌体21抗性区和lacI基因，lacUV5启动子，以及T7RNA聚合酶基因。这一区段被插入int基因，因此制止了DE3在没有辅助噬菌体时整合到染色体上或从染色体切出。一旦形成DE3溶原状态，就只有受IPTG诱导的lacUV5启动子指导T7RNA聚合酶基因转录，在溶原培养体系中加入IPTG诱导T7RNA聚合酶生产，继而质粒上的目的DNA开始转录。同时，尚有某些特殊设计的菌株以体现有特殊需要的重组蛋白，如甲硫氨酸营养缺点型体现硒代甲硫氨酸蛋白，溶解性增强的菌株体现毒性蛋白，补充了稀有密码子的菌株体现真核蛋白等，表2给出了惯用的大肠杆菌体现菌株。惯用体现菌株应用抗生素抗性B834met营养缺点性，对照株，不能使用T7启动子，蛋白酶敲除无B834(DE3)met营养缺点性，蛋白酶敲除无BL21对照株，不能使用T7启动子，蛋白酶敲除无BL21(DE3)常规体现宿主菌，蛋白酶敲除无BL21(DE3)高严紧体现宿主菌，蛋白酶敲除氯霉素（34μg/ml）BL21trxB(DE3)常规体现宿主菌，在胞质中形成二硫键，蛋白酶敲除卡那霉素（15μg/ml）BL21trxB(DE3)pLysS高严紧体现宿主菌，在胞质内形成二硫键，蛋白酶敲除卡那霉素（15μg/ml）氯霉素（34μg/ml）Origami对照株，不能使用T7启动子四环素（μg/ml）卡那霉素（15μg/ml）Origami(DE3)常规体现宿主菌，更加好的在中形成二硫键四环素（μg/ml）卡那霉素（15μg/ml）Origami(DE3)pLysS高严紧体现宿主菌，更加好的在中形成二硫键四环素（μg/ml）卡那霉素（15μg/ml）氯霉素（34μg/ml）Rosetta对照株，不能使用T7启动子，蛋白酶敲除氯霉素（34μg/ml）Rosetta(DE3)常规体现宿主菌，lac透性酶突变，能够控制体现水平，提供稀有密码子tRNAs，蛋白酶敲除氯霉素（34μg/ml）Rosetta(DE3)pLysS高严紧体现宿主菌，lac透性酶突变，能够控制体现水平，提供稀有密码子tRNAs，蛋白酶敲除氯霉素（34μg/ml）Rosetta-gami对照株，不能使用T7启动子四环素（μg/ml）卡那霉素（15μg/ml）氯霉素（34μg/ml）Rosetta-gami(DE3)常规体现宿主菌，更加好的在胞质内形成二硫键，提供稀有密码子tRNAs四环素（μg/ml）卡那霉素（15μg/ml）氯霉素（34μg/ml）Rosetta-gami(DE3)pLysS高严紧体现宿主菌，更加好的在胞质内形成二硫键，提供稀有密码子tRNAs四环素（μg/ml）卡那霉素（15μg/ml）氯霉素（35μg/ml）表2：惯用E.coli体现菌株质粒载体：大肠杆菌体现系统采用质粒为体现载体，质粒上的重要元件涉及复制子，启动子，终止子，多克隆位点，信号肽，融合标签，筛选标记等（图1）。原核体现载体已经发展得比较完善，有多个质粒可供选择(表4)。复制子：复制子决定着质粒载体在宿主中的拷贝数。普通状况下质粒拷贝数越高，重组蛋白的体现量就越高，但是高拷贝的质粒也会严重影响宿主的生长，质粒本身也不稳定，容易丢失和突变。克隆载体常采用拷贝数低、严谨复制的复制子，如pSC101；体现载体普通选用高拷贝的复制子，如pCoE1，pMBI（pUC），等。如果需要进行多个质粒的共转化，就要根据复制子的相容性选用不同复制系统的复制子，如pSC101和pUC共体现。启动子：体现重组蛋白时，我们需要考虑启动子的强弱、作用方式、调控方式和本底体现水平。体现载体普通选用强启动子以提高体现量，但弱启动子也有其优点，如减少本底体现、增加可溶体现、体现小量伴侣蛋白等。按照作用方式，启动子能够分为两类：构成型体现的启动子使宿主不停地体现重组蛋白，惯用于工业生产，如σS等；诱导型体现的启动子使宿主仅在受到诱导（诱导剂、温度等）时体现目的蛋白，诱导型启动子使重组蛋白的体现容易控制，同时减少了外源蛋白对细菌生长的影响。图1：大肠杆菌体现质粒pET-22b(+)图谱及多克隆位点早期大肠杆菌体现体系中，常见的启动子是lac和lacUV5。lac是一种弱启动子，很难使外源基因得到高体现。现在使用的含有需要小量共体现的蛋白(如分子伴侣，蛋白克制剂等)的载体，有诸多都采用了典型的lac启动子。强启动子中，tac和trc是lac启动子的变体，其重组蛋白产率能够达成细胞总蛋白量的15-30%。araBAD启动子的诱导剂是便宜无毒的L-阿拉伯糖，本底体现量低，启动能力比tac稍弱。T7则是现在原核体现系统中最高效的启动子，pET体现系统即是以它为中心构建的。T7启动子来源于λ噬菌体，专一与T7启动子结合的T7RNA聚合酶则被整合在宿主菌的基因组中。在λ噬菌体溶源的体现宿主菌，如BL21（DE3）中，lacI克制T7RNA聚合酶的体现，IPTG的加入能够解除这种克制。当受到诱导时，T7RNA聚合酶开始体现并结合在T7启动子上，启动重组蛋白的体现。T7RNA聚合酶活性很高，转录速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍，使其下游的重组蛋白得到高效体现，其产率能够达成细菌总蛋白量的50%以上。T7lac启动子则在T7启动子下游加入了一种lac操纵子，其中带有一种常规启动子和lac阻遏蛋白的编码序列。lac阻遏蛋白能够克制宿主合成T7RNA聚合酶，并阻断T7RNA聚合酶造成的目的基因转录，从而减少重组蛋白的本底体现水平。PL、cspA启动子使宿主菌能够进行温度依赖型的体现。在温度敏感型突变体菌株中，PL等启动子使得宿主在30℃时克制重组蛋白体现，而在42℃时诱导重组蛋白体现；cspA启动子则被高温（37℃）克制，低温（10℃）启动。温度诱导型的启动子避免了诱导剂的引入，减少了使用成本，同时也减少了诱导剂对细胞的伤害。终止子：转录终止子按照与否依赖和不依赖ρ因子的作用分为两类，这两类终止子均在终止点前含有一段7-20bp的回文序列。终止子能够保护mRNA在核外不被降解，明显延长mRNA的寿命，由此提高重组蛋白的体现量。但是对于T7系统来说，由于T7RNA聚合酶效率极高，宿主中随时都有充足的mRNA以供翻译，因此大部分在T7系统中体现的重组蛋白并不在乎质粒上与否有终止子，只有某些本身带有翻译起始信号的外源基因需要终止子。启动子受细胞类型的限制，在不同的细胞系中有很大不同，因此需根据宿主细胞（特别是真核宿主）的类型选择不同的启动子方便于目的基因的高效体现。融合标签：融合标签是与目的蛋白共体现的一段多肽，方便重组蛋白的纯化、固定和检测，表3给出了惯用的重组标签。如果不需要对重组蛋白进行纯化，尽量不要引入融合标签，以免影响蛋白性质；如果重组蛋白本身能够结合某种亲和柱，如某些金属结合蛋白能够结合Ni-NTA，某些糖结合蛋白能够特异识别糖类，也不必引入标签。融合标签的引入能够大大简化重组蛋白的纯化流程，并提高蛋白溶解度。商业化体现质粒，如pET、pGEX等提供了多个纯化标签和融合蛋白供选，应根据蛋白具体状况进行选择。His-tag是最惯用的纯化标签，它含有诸多优点：标签较短（10-20个氨基酸残基），不带电（），免疫原性差，普通不影响重组蛋白的构造和功效，Ni2+亲和力高，能够通过一步纯化达成60%-90%的纯度。如果蛋白质溶解度不高，造成折叠困难、体现量低，能够选择较大的融合标签（GST、MBP、Trx等）协助重组蛋白体现和折叠，提高重组蛋白溶解度，从而提高体现量。较大的融合标签有时也会造成翻译困难甚至提前中断，纯化后发现大部分都是标签蛋白也是常见现象。翻译的提前中断会大大影响重组蛋白产率和后续纯化，因此在短标签能够达成目的的时候，尽量不要选择大的融合标签。标签位置的选择也很重要：N端标签（短的或长的）本身带有启动子和适应宿主偏好的密码子，能够协助目的蛋白体现，提高体现量，但是提前中断翻译的蛋白片段也会被一并纯化出来，减少重组蛋白纯度，对蛋白酶敏感的、本身容易降解的以及一级序列中有集中的疏水残基区的蛋白特别要避免使用N端标签；C端标签则能够确保只有完整蛋白得到纯化。另外，如果蛋白的近N端或近C端有重要功效区，如酶活中心、配体结合位点、二硫键、多聚体稳定界面、互相作用界面等，则要避免纯化标签位于该末端，以免影响重组蛋白的构造和功效。如果融合标签对蛋白性质有较大影响，但又是纯化所必须的，就能够考虑在纯化过程中去除标签。重要有三种办法：化学裂解，如溴化氰（CNBr）、羟胺（NH2OH）等，能够简朴有效地去除标签，但反映条件苛刻（羟胺需要在下反映），特异性较差，并且会引入不必要的修饰，除包含体蛋白的解决外已经极少使用了；酶解，如PPase等，其底物普通是一段比较长的肽链，特异性强，是现在比较惯用的办法，缺点是酶切反映需要较长的时间，也增加了蛋白纯化的环节，使纯化变得繁琐；IMPACT质粒，该质粒在纯化标签和目的蛋白之间插入了一种蛋白质内含子（intein），intein含有可诱导的自切割活性，使用IMPACT质粒体现的重组蛋白，只需要变化缓冲液的pH和温度，即可切掉融合标签。标签N/C端或内部（I）大小（氨基酸残基）鉴定/纯化原理T7-TagN，I11单克隆抗体S-TagN，I15S-蛋白亲和His-TagN，C，I6金属螯合层析HSV-TagC11单克隆抗体pelBlampTN20细胞周质定位KSIN125疏水区Trx-TagN109提高细胞质可溶性，单克隆抗体PKAsiteI5蛋白激酶A识别位点CBDclos-TagN156纤维素结合CBDcenA-TagN114纤维素结合，细胞周至/培养基定位CBDcex-TagC107纤维素结合，细胞周至/培养基定位DsbA-TagN208细胞周质定位DsbC-TagN236细胞周质定位GST-TagN220提高细胞质可溶性，谷胱甘肽亲和MBP-TagN，I370提高细胞质可溶性，麦芽糖亲和Nus-TagN，I495提高细胞质可溶性，单克隆抗体表3：惯用融合标签筛选标记：在没有压力的环境下培养时，细菌中的外源质粒经常随着细胞复制而丢失。为了稳定质粒、体现重组蛋白，需要在载体中加入筛选标记，使宿主菌在原则压力下生长。原核系统中，常见的筛选标记有蓝白斑筛选（重要用于克隆）、营养缺点性筛选和抗生素筛选，也能够将几个筛选手段混合起来使用。常见的抗生素筛选标记有：青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性、四环素抗性等。氨苄青霉素由于会被抗性细菌分泌的β-内酰胺酶和酸性环境破坏掉，其筛选效果会随时间减少，不适宜持续发酵，将抗性基因反转或换用对低pH不敏感的羧苄青霉素能够部分解决这个问题；卡那霉素不会被破坏，抗性较强，但是不同菌株的抗性差别较大，平板培养和悬浮培养液有所不同，使用时常需要针对个别菌株探索适宜浓度；氯霉素抗性常见于有特殊用途的菌株和质粒，如pLysS。抗生素浓度的过高或过低都会减少重组蛋白的体现量，另外在使用多个载体进行共体现时，应注意不同的质粒要携带不同的筛选标记，抗生素浓度也要比单独体现合适减少。分泌体现：如果不但愿重组蛋白体现在细胞质中，能够在重组蛋白的N端加入信号肽，引导蛋白穿越细胞膜。大肠杆菌的分泌体现普通是分泌到周质空间，多个芽孢杆菌则能够分泌到培养基中，简化纯化流程。分泌体现的体现量普通远远低于胞质体现，但是也有其优势：跨膜过程能够协助重组蛋白折叠，提高其溶解性和活性；周至空间和培养基的氧化环境能够协助二硫键形成；也可用于除去牢固结合在蛋白上的配体；分泌到细胞外还能减少有毒重组蛋白对细胞的影响。载体启动子抗生素抗性融合标签1蛋白酶信号肽pET:NovagenpET-3a-dT7ampRT7pET-11a-dT7lacampRT7pET-15bT7lacampRHis凝血酶pET-17bT7ampRT7pET-19bT7lacampRHis肠激酶pET-20bT7ampRHis有pET-21a-dT7lacampRHis，T7pET-22bT7lacampRHis有pET-23a-dT7ampRHis，T7pET-24a-dT7lackanaRHis，T7pET-28aT7lackanaRHis，T7凝血酶pET-30a-cT7lackanaRHis，S凝血酶，肠激酶pET-31bT7lacampRHis凝血酶，肠激酶pET-32a-cT7lacampRHis，S，Trx凝血酶，肠激酶pET-35bT7lackanaRHis，S，CBD凝血酶，Xa因子pET-37bT7lackanaRHis，S，CBD凝血酶，Xa因子有pET-39bT7lackanaRHis，S，Dsb凝血酶，肠激酶pET-41a-cT7lackanaRHis，S，GST凝血酶，肠激酶T7lacampRHis，S，HSV，Nus凝血酶，肠激酶pGEX:GEpGEX-1λTtacampRGST凝血酶pGEX-2TKtacampRGST凝血酶，肠激酶pGEX-3XtacampRGSTXa因子pGEX-4T-1tacampRGST凝血酶pGEX-5X-1tacampRGSTXa因子pGEX-6P-2tacampRGSTPpasepMAL:NEBpMAL-c2X/E/GtacampRMBPXa因子/肠激酶/GeneasepMAL-p2X/E/GtacampRMBPXa因子/肠激酶/Genease有表4：惯用原核体现载体质粒优化体现条件重组蛋白的体现流程极少有一次成形的，为了提高蛋白体现量、改善蛋白质量，体现条件和流程的优化是必须的。当重组蛋白不体现时：如果重组蛋白不体现（包含体和可溶蛋白都没有），首先检查cDNA和质粒与否对的，蛋白对宿主菌与否有很大毒性，然后尝试更换菌株、质粒载体和融合标签。原核蛋白在大肠杆菌中不能体现的状况极少见，普通是真核蛋白不能体现。不能体现的重组蛋白，即使在更换了宿主、载体后能够体现，体现量也不会很高，如果需要大规模生产，最佳尝试酵母和昆虫细胞体现系统。当体现量不抱负时：检查密码子构成，使其适应宿主菌的密码子偏好。稀有密码子，特别是位于重组蛋白N端的和大量集中的稀有密码子，会减少mRNA稳定性，明显减少翻译速度，引发翻译提前中断、翻译移码和突变。将这些稀有密码子（特别是N端！）突变为宿主偏好的密码子，能够明显提高体现水平，必要时能够根据宿主的偏好重新合成cDNA。另一种解决措施是与能够体现稀有tRNA的质粒共体现或直接采用带有该质粒的宿主菌，如BL21codonplus、Rosetta等。更换菌株容易引发一系列问题，如启动子相溶性、额外的抗生素抗性等，使用时要多加注意。检查外源基因cDNA5’端构造，高GC含量、回文构造和相距较近的两个起始密码子会妨碍转录起始，体现量不抱负时应予以去除；检查终止密码，mRNA的通读会减少重组蛋白的质量和稳定性。不同终止密码子的终止效率在不同的物种中有很大差别，酵母和哺乳动物偏爱UAA和UGA，昆虫和大肠杆菌倾向于用UAA；终止密码子3’端紧邻的碱基也会影响终止效率，对于UAG来说，终止效率U、A>C>G，其它终止密码G>U、A>C；也能够多加一种终止密码子，以确保翻译在对的的位点结束。变化融合标签的位置，N端的标签能够协助翻译起始，从而提高蛋白的体现量。可溶体现低时：错误折叠是引发重组蛋白可溶体现量低，包含体体现量高的一种重要因素。改善重组蛋白折叠的办法有：减少诱导后培养温度。重组蛋白体现得越慢，其折叠效果就越好，大肠杆菌在4℃时仍然能够体现重组蛋白，而将培养温度减少至25-30℃就能明显改善蛋白折叠。此办法不合用于温度诱导的重组蛋白体现；减少诱导剂。诱导剂浓度能够减少至1/10；选用Lac渗入酶缺点型菌株，如Tuner、Rosetta等，也有较好的效果。这类菌株能够使进入每个细胞的诱导剂浓度相似。重组蛋白在全部细胞中的体现水平相称时，减少诱导剂的效果更加好；增加一种融合标签，或者更换一种分子量更大的标签。普通来说，越大的融合标签在提高重组蛋白溶解度方面效果越好，如MBP、GST的效果要优于His6标签。以改善溶解度为目的的融合标签最佳放置在目的蛋白的N端；改善二硫键的形成。大肠杆菌细胞内的还原环境会妨碍二硫键的形成，如果要体现有一对或多对二硫键、特别是需要二硫键来稳定分子内和分子间构造的重组蛋白，最佳选用通过特别设计的载体和菌株，如pET39b(+)和pET40b质粒、BL21trxB，Origami和Rosetta-gami菌株。也能够考虑将蛋白分泌至周至空间，运用周至空间的氧化环境和酶来协助二硫键的形成；只体现蛋白的可溶片段。可溶片段突变体与全蛋白之间经常有很大差别，如等电点、抗原性、寡聚状态、活性、细胞定位等，突变时一定要谨慎考虑；突变掉可能引发顺反异构的Pro。顺反异构随着着很高的能量跃迁，是蛋白折叠的能量壁垒。突变掉这样的Pro能够明显协助重组蛋白折叠，但是同样会变化蛋白性质，要谨慎考虑；与分子伴侣和折叠酶共体现。微量的分子伴侣即可明显改善重组蛋白的折叠状况，与重组蛋白同源的分子伴侣效果更加明显。引入分子伴侣同样也会引发复制子相容性、额外的抗生素抗性等问题，惯用的分子伴侣有ATP依赖的DnaK-DnaJ-GrpE和GroEL-GroES，以及定位于周质空间的分子伴侣SurA、PpiD等。折叠酶能够协助蛋白跨过折叠过程的能量壁垒，使重组蛋白更快更加好的折叠；在重组蛋白N端加入信号肽，将其引导至周质空间，用跨膜过程来协助蛋白折叠和二硫键形成，并减轻蛋白降解；在培养基中加入重组蛋白的配体或底物类似物。配体结合，有时仅仅是配体的存在就能大幅度的改善蛋白的折叠和稳定性，此法不合用于无法被细菌摄取的配体；如果是多个蛋白共体现，能够考虑用一段柔软的linker将两个蛋白连接起来，使溶解度好的蛋白协助溶解度差的蛋白折叠；改善蛋白稳定性。能够引发蛋白降解的因素诸多，从蛋白本身性质到宿主性质不一而足，如果重组蛋白在体现时就被降解，体现量和稳定性就会受到很大影响。在大肠杆菌中体现重组蛋白，需要切记N端法则：当N端第二个残基是Leu、Arg、Lys、Phe、Tyr和Trp时，重组蛋白半衰期只有2分钟，而小侧链的氨基酸残基，如Ala，则能够提高蛋白稳定性。因此在设计载体时，要特别注意第二个密码子，避免上述残基的出现。解决高毒性蛋白：外源基因的体现对大肠杆菌总有或多或少的影响，普通来说，通过改造的宿主能够在很大程度上容忍重组蛋白，重组蛋白能够占到细胞总蛋白量的50%或更高。但少数毒性极高的重组蛋白，其本底体现就会杀死原核宿主，质粒容易丢失，使其在大肠杆菌中很难得到高体现。下列办法能够减少重组蛋白的本底体现量。在培养基中加入1%的葡萄糖。葡萄糖是大肠杆菌的第一碳源，它的存在能够明显减少由其它碳源引发的本底体现。采用严格启动的载体和宿主。如PBAD载体、pLacI宿主。采用低拷贝数的载体。减少体现载体质粒的拷贝数，能够明显减少基础体现水平。如pETcoco载体在每个细胞中仅一种拷贝，而受到IPTG诱导时又能够高效体现重组蛋白。采用可体现T7溶菌酶的宿主。T7溶菌酶是T7RNA聚合酶的克制剂，采用含有T7溶菌酶质粒的宿主，如pLysS，能够减少重组蛋白在大肠杆菌快速生长久的本底体现量，在受到IPTG诱导时也能较好的体现蛋白。除此之外，也能够通过共体现重组蛋白的克制剂、提高抗生素浓度等办法提高毒性蛋白的体现量。包涵体体现：在使用高效的E.coli体现系统时，过量体现的重组蛋白常会在细胞内凝聚，形成无活性的包涵体沉淀。在早期实验中，包涵体被认为是重组蛋白体现的大敌：包涵体蛋白折叠混乱、二硫键配对混乱、没有生物活性、变复性条件需要长时间探索等，即使包涵体蛋白成功复性，其均一性和活性仍然备受质疑。但是包涵体体现也有其优势：能够很轻松的获得超高的体现量，不可溶的重组蛋白不会被宿主内的蛋白酶降解，重组蛋白的毒性被大大克制，杂蛋白含量低（~10%），容易纯化等。由于这些优点以及蛋白质复性条件的不停发展，体现包涵体蛋白逐步为人们所接受，成为重组蛋白体现的一种惯用方案。与可溶蛋白相反，提高培养温度、延长培养时间、在较高的菌密度下诱导都有助于包涵体的形成；在破菌和变性溶解时加入还原剂能够打开错配的二硫键；在复性液中加入二硫键异构酶、脯氨酸异构酶、分子伴侣和蛋白的辅助因子能够协助重组蛋白折叠；精氨酸和高分子量PEG能减轻蛋白分子的聚集；尝试多个物理手段，如透析、快速稀释和柱上复性等，有时对复性有奇效。包涵体的体现相对简朴，但其复性过程仍是依赖经验的，没有通用的办法能够套用。3.酵母体现系统酵母体现系统兼有原核和高等真核系统的优点。酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度快速，能够耐受较高的流体静压，用于体现基因工程产品时，能够大规模生产，有效减少了生产成本。酵母体现外源基因含有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白质含有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核体现的蛋白质更加稳定，特别适合于体现真核生物基因和制备有功效的体现蛋白质。某些酵母体现系统含有外分泌信号序列，能够将所体现的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化。应用酵母体现系统生产外源基因的蛋白质产物时也有局限性之处，如产物蛋白质的不均一、信号肽加工不完全、内部降解、多聚体形成等，造成体现蛋白质在构造上的不一致。另外，还时常碰到体现产物的过分糖基化状况。因此，体现系统应根据具体状况作合适的改善。惯用酵母体现系统(宿主-载体系统)酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)体现系统由于遗传和生理背景清晰并且安全，酿酒酵母是最早应用于重组蛋白体现的酵母宿主菌。体现菌株：INVSC1是酿酒酵母体现系统的惯用菌株，它是一种双倍体营养缺点细胞株，在缺少组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶的培养基中（如SC基本培养基）不能生长。GAL1是酿酒酵母体现系统中惯用的启动子，以半乳糖作为碳源能够诱导转录起始，葡萄糖则克制转录。在葡萄糖培养基中，重组蛋白只有本底水平的体现，收集菌体并转入只含半乳糖的培养基能够诱导重组蛋白体现。也能够使用棉子糖替代葡萄糖作为碳源，棉子糖对GAL1启动子没有影响，既不会克制也不会激活，在菌体达成一定浓度之后直接加入半乳糖即可诱导重组蛋白体现。酿酒酵母能够对重组蛋白进行乙酰化修饰，以及没有位点特异性的Ser/Thr磷酸化修饰，还能够进行AsnN-糖基化和Ser/ThrO-糖基化修饰。酿酒酵母的糖基化修饰采用单一的甘露糖残基，N-糖基化修饰由1，3-和1，6-甘露糖残基构成，往往形成40-200个甘露糖残基的较大糖链，通过基因改造能够阻断N-糖基化过程，使糖链缩短为Man8GlcNAc2核心糖链，糖链末端为1,3-甘露糖，使重组蛋白的抗原性明显增强。O-糖基化则由不超出5个的甘露糖残基聚合而成。体现质粒真核体现系统常采用穿梭质粒为体现载体。穿梭质粒含有两套复制子和启动子，以及对应的筛选标记，能够在原核和真核两种宿主中分别完毕复制和体现，以方便对质粒进行遗传操作和大量制备。酿酒酵母本身含有质粒，其体现载体能够有自主复制型和整合型两种。自主复制型质粒中，高拷贝载体普通采用酵母天然质粒的复制子，如2μ复制子，以使载体在宿主中达成较高的拷贝数（10-40），并独立于宿主染色体进行复制；低拷贝复制子则采用从酵母染色体中的自主复制序列（ARS）作为复制子，在宿主中严紧复制，普通一种细胞只有1-2个拷贝。真核体现载体惯用的筛选标记有营养缺点型（如URA3、TRP1）和抗生素抗性（如灭瘟素、G418等）。载体启动子筛选标记融合标签pYES2μ2URA3无pYES2/NTμ2URA3XpresspYES2CTμ2URA3V5,HispYES3/CTμ2TRP1V5,HispYES6/CTμ2灭瘟素V5,HispYC2/NTCNE6/ARSH4URA3XpresspYC2/CTCNE6/ARSH4URA3V5,HispYC6/CTCNE6/ARSH4灭瘟素V5,His表5：惯用酿酒酵母体现载体整合型质粒（如Yip5）不含ARS，必需整合到染色体上，随染色体复制而复制。整合过程是高特异性的，但是拷贝数普通很低。多拷贝整合载体pMIRY2通过将目的基因靶向整合到rDNA簇上(rDNA簇为酵母基因组中串联存在的150个重复序列)克服了这个缺点，运用pMIRY2质粒能够得到100个以上的拷贝。酿酒酵母作为体现菌株含有一定的局限性，如缺少强有力的启动子，重组蛋白产率往往只有全细胞蛋白的5%左右；难于高密度培养；分泌效率低，几乎不分泌分子量不小于30kD的外源蛋白，有时蛋白只被分泌到周至空间而非培养基中；重组蛋白容易过分糖基化；内部降解复杂，重组蛋白的C端往往被截短。因此，现在普通使用甲醇酵母替代酿酒酵母，用于重组蛋白质的真核体现。毕赤酵母（P.Pastoris）体现系统毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母，能够依赖甲醇作为唯一碳源生长，甲醇能够诱导代谢所需的酶的体现。现在发现的全部甲醇营养型酵母，其甲醇代谢途径都是相似的，甲醇首先被乙醇氧化酶（AOX）氧化，生成甲醛和过氧化氢。为了避免过氧化氢毒害细胞，这步反映在过氧化物酶体中进行。在毕赤酵母中，AOX有两个编码基因：AOX1和AOX2，其中AOX1基因编码了细胞内绝大多数的乙醇氧化酶。AOX1的体现受AOX启动子的严风格控，本底体现水平极低，而甲醇诱导体现量能够达成细胞总蛋白的30%以上，使用AOX启动子使得重组蛋白能够达成很高的体现量。毕赤酵母中，His+转化子能够自发的进行高拷贝整合，概率为1-10%，选择带有HIS4基因的体现载体即能够提高外源基因的拷贝数，从而提高重组蛋白的体现水平。毕赤酵母也是重组蛋白分泌体现的抱负宿主。毕赤酵母本身只分泌体现少量蛋白，并且能够使用不含蛋白的培养基，因此分泌体现的重组蛋白在培养基中占据了绝对优势，大大简化了纯化环节。体现菌株：毕赤酵母的体现菌株都是由野生型石油酵母NRRL-Y11430改造而来，含有一种或几个营养缺点（如his4、arg4等）以方便筛选（表6）。研究发现，敲除了AOX基因的菌株有时能更加好的体现外源蛋白，并且诱导所需的甲醇量也大大减少了。按照AOX基因的敲除状况和运用甲醇的能力，毕赤酵母体现菌株能够分为3类：在甲醇培养基中快速生长的Mut+；敲除了AOX1，在甲醇培养基中慢速生长的MutS和敲除了两个AOX基因，不能运用甲醇的Mut-。不同的表型能够用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。除此之外，尚有敲除了蛋白酶（prb1、pep4）的菌株，以保护重组蛋白不受宿主蛋白酶的攻击。蛋白酶缺点型的菌株生长比较缓慢。与酿酒酵母相似，毕赤酵母也能够进行二硫键形成、磷酸化、乙酰化、糖基化等翻译后修饰，也只能运用甘露糖残基对蛋白进行糖基化修饰。毕赤酵母的N-糖基化糖链较短，平均每个支链8-14个甘露糖残基，有助于重组蛋白的分子均一性；并且糖链中和糖链末端都没有1,3-甘露糖，对重组蛋白抗原性的影响也比酿酒酵母低。毕赤酵母体现菌株甲醇运用表型营养缺点蛋白酶敲除X-33Mut+--GS115Mut+组氨酸缺点-KM71MutS组氨酸、精氨酸缺点-KM71HMutS精氨酸缺点-MCIO0-3Mut-组氨酸、精氨酸缺点-SMD1163Mut+组氨酸缺点PEP、PRB敲除SMD1165Mut+组氨酸缺点PRB敲除SMD1168Mut+组氨酸缺点PEP敲除SMD1168HMut+-PEP敲除表6：惯用毕赤酵母体现菌株体现载体：毕赤酵母本身没有质粒，自主复制型载体普通不稳定，因此普通采用整合型载体。整合型载体的外源基因体现盒由几部分构成：AOX启动子、多克隆位点、融合标签、AOX终止子，有时尚有一段AOX1基因的3’端非编码区，方便将外源基因体现盒导入基因组中的AOX1位点。某些载体还含有外分泌信号肽，使重组蛋白分泌至培养基中。某些载体允许构建多个串联的外源基因体现盒，以弥补整合型载体拷贝数量的缺点。构成型体现的GAP启动子能够替代AOX启动子：GAP启动子不需要甲醇诱导，体现水平较高，操作简朴，但不能体现对宿主有高毒性的蛋白。除体现盒之外，载体上尚有筛选标记（营养缺点互补基因、抗生素抗性基因）和在细菌中进行拷贝增殖所必须的序列（启动子、终止子、复制子、抗生素抗性基因等）。遗传霉素G418抗性和博来霉素Zeocin抗性是惯用的抗生素筛选标记，惯用于外源基因多拷贝的筛选。博来霉素抗性由于基因很小（375bp），易于操作，并且也能对原核宿主进行筛选，逐步成为人们偏爱的筛选标记。载体质粒需要首先进行线性化，才干重组到宿主染色体中。克隆载体上普通有多个线性化酶切位点供选。基因重组能够发生在基因组中AOX基因区域和对应的质粒AOX区域之间，涉及AOX启动子、终止子和3’非编码区。通过选择不同的线性化位点控制重组和外源基因的插入，能够造成宿主的不同甲醇运用表型（Mut+/Muts）。如选择AOX启动子和3’端非编码区的酶切位点，会造成染色体中的AOX基因被置换下来，使Mut+表型的宿主变为Muts。如果需要多拷贝的外源基因，能够使用带有HIS4基因的载体，并选择HIS4中的酶切位点进行线性化。这个线性化位点不会影响宿主的甲醇运用表型，最后得到的体现菌株表型与宿主相似。图2：酵母体现载体pPIC9K质粒图谱惯用毕赤酵母体现载体启动子拷贝数分泌信号肽筛选标记融合标签AOX1低-HIS4-AOX1高-HIS4，遗传霉素-pPIC9AOX1低α因子HIS4-pPIC9kAOX1高α因子HIS4，遗传霉素-pAO815AOX1高-HIS4-pHIL-S1AOX1低PHO1HIS4-pHIL-D2AOX1低-HIS4-pPIC6A,B,CAOX1低-灭瘟素c-myc抗原，HispPIC6αA,B,CAOX1低α因子灭瘟素c-myc抗原，HispPICZαA,B,CAOX1低α因子博来霉素c-myc抗原，HispPICZA,B,CAOX1低-博来霉素c-myc抗原，HispGAPZαA,B,CGAP低α因子博来霉素c-myc抗原，HispGAPZA,B,CGAP低-博来霉素c-myc抗原，His表7：惯用毕赤酵母体现载体体现条件的优化：检查外源基因的一级序列：5’端不能有回文构造；密码子构成需要适应宿主的密码子偏好，特别是N端前几个，如使用了酵母厌恶的密码子会大大影响体现量；高AT含量的序列会使转录提前中断；检查重组蛋白序列，分泌体现时需要糖基化位点Asn-X-Ser/Thr。宿主表型：尝试Mut+/MutS/Mut-表型的宿主，不同的基因在不同的宿主菌中可能体现量截然不同，多试几个菌株，挑选最优的体现体系。胞内体现尽量使用MutS和Mut-的宿主菌，以减少乙醇氧化酶的体现，提高重组蛋白产率。多拷贝转化子的筛选：在使用、pPIC9等多拷贝载体时，需要对转化子进行大量的筛选工作。以抗生素为筛选标记时，由于酵母的耐受能力与细胞密度有关，可能会出现假阳性，对挑选出来的高抗性转化子，还应做进一步的PCR验证，也能够省略平板筛选，直接做PCR鉴定。高克隆并不能一定带来高体现，体现菌株的最后拟定应以体现量为准。在体现分子量不大的蛋白时能够考虑换用pAO815载体，pAO815能够精确控制外源基因拷贝数，一次转化即可获得含有对的数目插入的转化子，从而省去了转化子的筛选工作，其缺点是克隆复杂，载体较大。细胞定位：不是全部蛋白都适合分泌体现，如果重组蛋白本身定位于胞质中并且没有糖基化位点，应当尝试胞内体现。培养基：重组蛋白分泌体现时，最佳选用pH可在较宽范畴内变化的磷酸缓冲液培养基，优化培养基pH值能提高蛋白体现量和稳定性。基本培养基能够简化纯化过程，丰富培养基则使体现菌株的生长更加好，尚有助于稳定重组蛋白，体现量偏低时最佳使用丰富培养基。培养基中的甘油浓度有时也会影响重组蛋白的体现量和活性，甘油浓度过高会影响培养基溶氧量，需注意。甲醇浓度：不同的宿主-载体-重组蛋白体系的最优甲醇诱导浓度是不同的，从%-5%都有可能，是需要优化的一种重要体现条件。摇瓶培养时甲醇浓度不易监测，需要根据经验补加；发酵培养则能够实现甲醇浓度的精确控制，有助于重组蛋白的高体现。细胞密度：提高细胞密度能够明显提高重组蛋白的体现量。在培养基中添加不会克制AOX启动子的碳源，如山梨糖醇、甘露糖、海藻糖、丙氨酸等，能够提高生物量。摇瓶培养效果不佳时，能够考虑发酵培养。蛋白酶：酵母细胞中有多个蛋白酶，也会分泌某些中性蛋白酶至培养基中。如果重组蛋白对这些酶敏感，能够通过几个办法减轻蛋白酶的影响：减少培养基pH值，使蛋白酶失活；提高培养基中的蛋白含量，加入1%酪蛋白水解物，用杂蛋白保护重组蛋白；换用蛋白酶敲除的宿主菌。溶氧量：越高越好。毕赤酵母的生长对氧气规定不高，高效体现则需要大量氧气。使用摇瓶体现时，减少培养基体积并提高转速能够明显提高菌液溶氧量，如果培养基中加有抗生素，甚至能够去掉棉塞，只用4-8层纱布封口。温度：培养温度超出30℃将使酵母的生长和体现趋于停滞，如果摇床或发酵罐温度不稳，设立在28℃。过糖基化：重组蛋白的过糖基化不仅影响均一性，并且有时还会影响体现量。尝试胞内体现、敲除N-糖基化位点能够减少重组蛋白的糖基化水平，也能够在纯化时加入酶切除过长的糖链以提高蛋白均一性。菌株老化：体现菌株多次传代后体现量会明显减少，有时体现第一次、第二次产量都很高，然后忽然下降。长久体现时应注意保持菌株的新鲜：用原始菌株多做某些甘油菌，-80℃冻存，每次体现之前都取出一管重新划线。重组蛋白不分泌或分泌量低：在分泌之前，重组蛋白必须对的折叠并形成对的的二硫键，错误和不当折叠都会干扰分泌通路。共体现辅助因子，如分子伴侣（Hsp70、90家族）、二硫键异构酶Pdi，过体现未折叠蛋白对应转录因子Hac1p（诱导分子伴侣和分泌通路酶的体现）等办法能够协助重组蛋白进入分泌通路，提高分泌体现量和蛋白活性。4.昆虫细胞体现系统昆虫细胞体现体统适宜体现高等真核生物蛋白。昆虫细胞在培养中能够达成较高的细胞密度，含有复杂的翻译后修饰，如蛋白质的对的折叠与切割、二硫键形成、糖基化、磷酸化、酰化、酰胺化、羧甲基化等，诸多修饰过程与哺乳动物都是相似的。与酵母相似，昆虫细胞也能够进行胞内和分泌体现，启动子很强，重组蛋白体现量高，并且更适宜体现多元蛋白复合物。昆虫细胞体现外源重组蛋白可运用质粒转染和病毒载体的感染。运用质粒转染能够获得稳定的转染细胞，但实验周期较长，需几周甚至几个月时间，适宜持续发酵培养；运用病毒体现系统则可快速感染细胞，在几天内使外源基因整合到病毒载体中，合用于目的蛋白的体现检测。昆虫细胞体现系统现在惯用的昆虫细胞体现系统有杆状病毒-昆虫系统、InsectSelect稳定体现系统和果蝇体现系统三种。杆状病毒-昆虫（BaculovirusExpressionVectorSystem,BEVS）体现系统：杆状病毒（baculovirus）是一类以昆虫细胞为天然宿主的核型多角体病毒，其基因组为80-160kb大小的单一闭合双链超螺旋DNA，约编码154个基因。现在研究较多的是苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)。AcNPV基因组含有较大的柔韧性，能够容忍较大片断的外源基因和多个外源基因的插入，病毒感染后期，宿主细胞会被裂解，因此BEVS不适于持续培养。AcNPV能够感染大概30种鳞翅类昆虫细胞，在一定条件下也能够感染果蝇细胞，其中草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda，Sf)卵巢细胞和粉纹夜蛾（Trichoplusiani）胚胎细胞被发展成最惯用的体现宿主。杆状病毒惯用的体现宿主有来源于草地贪夜蛾的Sf9、Sf21和来源于粉纹夜蛾的High-Five、Tn-368，这些细胞质生长较快，能够达成较高的细胞密度，适应悬浮培养，能够使用无血清培养基，是重组蛋白体现的抱负宿主。由于昆虫细胞的N-糖基化与哺乳动物细胞有较大差别，人们设计了能够持续体现多个糖基转移酶的MimicSf9细胞，用以体现更高等生物的蛋白。AcNPV的基因体现分为立早期体现、早期体现、晚期体现、极晚期体现4个阶段。前两个阶段的基因体现早于DNA复制，而后两个阶段的基因体现则随着着一系列的病毒DNA合成。其中在极晚期基因体现过程中，有两种高效体现的蛋白：多角体蛋白和P10蛋白。多角体蛋白是形成包含体的重要成分，感染后期在细胞中的积累可高达30％~50％，是病毒复制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定和感染能力；P10蛋白也是病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。多角体基因和P10基因的启动子含有较强的启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒体现载体系统抱负的外源基因插入位点。如将外源基因取代多角体蛋白基因构成重组病毒，病毒体内不含有包含体。不形成包含体的病毒和形成包含体的病毒在平板中形成的空斑不同,运用这一特性筛选含有外源基因的重组病毒。使用BEVS系统需要将外源基因整合入杆状病毒基因组中。解决这个问题重要有两种思路：Bac-to-Bac系统改造了AcNPV基因组，将之构建成为一种超大的穿梭质粒（130k），使其能够在大肠杆菌中复制（单拷贝），再将带有外源基因的供体质粒转入带有病毒质粒的大肠杆菌中，使它们在原核宿主体内完毕重组过程，将体现盒插入多角蛋白启动子下游，纯化后感染昆虫细胞收集重组病毒；In-Fusion系统将野生型杆状病毒线性化，与带有外源基因和同源重组序列的载体直接共转染宿主细胞，只有对的重组的病毒才干进行自我复制并裂解宿主，以此来制备重组病毒。不管使用哪种办法，都需要在收集到大量重组病毒后再感染新鲜宿主，以获得高质量的重组蛋白。稳定体现系统InsectSelect系统和果蝇体现系统都是使用整合型质粒载体的重组蛋白体现系统。整合型载体能够实现重组蛋白的持续发酵，外源基因随机整合入染色体，体现受插入位点的影响，同时还可能会变化宿主细胞的生长特性，因此需要做大量的筛选工作才干获得稳定的体现菌株。InsectSelect（IS）系统：IS系统能够进行重组蛋白的昆虫细胞持续分泌培养。此系统使用的载体为pMIB/V5-HisA，B，C质粒，涉及OpIE2、OpIE1启动子、蜜蜂蜂毒分泌信号肽（HBM）、灭瘟素抗性基因、C端V5抗原和His标签，以及在大肠杆菌中复制所必须的组分。OpIE2、OpIE1启动子来源于杆状病毒OpMNPV，该病毒的天然宿主为冷杉合毒蛾Orgyiapseudotsugata，惯用的体现宿主有Sf9、Sf21、HighFive、Kc1（果蝇）、S2（果蝇）。OpIE2启动子比OpIE1强5-10倍，用于外源基因的体现，后者则用于灭瘟素抗性基因的体现。OpIE2为构成型强启动子，与HBM信号肽协同，使得重组蛋白能够在昆虫细胞中进行持续分泌培养。质粒C端有可选的V5抗原和His标签，方便重组蛋白检测和纯化。外源基因插入载体后在大肠杆菌中扩增，纯化后转染宿主细胞。一旦宿主细胞成功体现重组蛋白，即可运用灭瘟素抗性进行筛选，获得高拷贝的细胞株进行持续发酵。IS系统使用的质粒很小（），易于操作，体现流程相对简朴，能够进行持续发酵，有些重组蛋白在IS中的体现量比BEVS还高，是一种比较实用的昆虫体现系统。表3：昆虫体现载体pMIB/V5-HisB质粒图谱果蝇体现系统（DrosophilaExpressionSystem，DES)：果蝇体现系统使用S2果蝇细胞为体现宿主，能够进行重组蛋白的胞内、分泌体现，能够持续体现。在培养瓶中，S2松散半贴壁单层生长，同时也能够较好的适应摇瓶和发酵罐的悬浮培养，能够使用无血清培养基。外源基因在S2细胞系普通能够达成500-1000个拷贝。DES有多个体现载体，涉及构成型/诱导体现、胞内/分泌体现，能够适应不同的需要。诱导体现的载体使用果蝇金属硫蛋白基因（MT）启动子。MT启动子是一种严紧调控的强启动子，即使在很高的拷贝数下也能够维持低水平的本底体现。硫酸铜或氯化镉能够解除克制，体现MT启动子的下游基因。MT启动子在其它昆虫细胞系（如Sf9，Sf21，HighFive）中体现不佳，仅能在S2细胞系中使用。DES的体现载体均没有果蝇细胞的筛选标记，只能用于短期体现，要建立稳定体现的细胞株，必须将带有外源基因的载体和筛选载体共转染。惯用的筛选载体有携带潮霉素抗性基因的pCoHygro和携带灭瘟素抗性基因的pCoBlast。将筛选载体和体现载体共转染宿主细胞，即可根据宿主耐药性选出高拷贝的细胞株。图4：果蝇细胞体现载体pMT/V5-His质粒图谱果蝇体现体统惯用载体启动子体现类型细胞定位融合标签pMT/V5-HisMT诱导胞内V5，HisV5-HisAc5构成胞内V5，HispMT/BiP/V5-HisMT诱导分泌V5，HispMT/BioEase–DESTMT诱导胞内生物素表8：果蝇体现体统惯用载体昆虫细胞体现优化：检查外源基因的一级序列：外源基因5’端不能有回文构造；密码子构成需要适应宿主的密码子偏好，特别是N端前几个；高AT含量的序列会使转录提前中断；检查重组蛋白序列，分泌体现时需要糖基化位点Asn-X-Ser/Thr，避免蛋白N端出现“PEST”——脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸，N端PEST使重组蛋白容易降解。尝试多个外源基因-载体-宿主组合：不同的载体-宿主体统适合体现的蛋白是不同的，重组蛋白体现量不高时应多尝试几个组合。宿主细胞状态：杆状病毒应在适合的时机感染宿主细胞，生长阶段、细胞密度、病毒量、收获时间都值得优化，特别是使用无血清培养基时，细胞密度要对应增加。诱导体现系统同样如此。培养基：培养基成分对重组蛋白体现量和质量都有影响，能够考虑增加或减少培养基中某种组分（如血清等），也能够考虑将几个培养基按比例混合使用。转速和溶氧量：娇嫩的昆虫细胞不一定能适应高转速培养，这就使培养基中的溶氧量受到了限制，优化转速使细胞状态达成最佳，发酵培养时还应优化培养基氧气饱和度，以提高外源蛋白的体现量。共体现辅助因子：在杆状病毒体现系统中，过体现抗凋亡基因，如人源bcl-2和杆状病毒P35能够延长宿主寿命；P-vank-1基因则能够提高分泌体现量。RecentpatentsonthePichiapastorisexpressionsystem:expandingthetoolboxforrecombinantproteinproduction.Recentpatentsonbiotechnology3,192-201().Cregg,.etal.ExpressionintheyeastPichiapastoris.Methodsinenzymology463,169-189().Hamilton,.&Gerngross,.Glycosylationengineeringinyeast:theadventoffullyhumanizedyeast.Currentopinioninbiotechnology18,387-392().5.哺乳动物体现系统与其它系统相比，哺乳动物细胞体现系统的优势在于能够指导蛋白质的对的折叠，提供复杂的N-糖基化和精确的O-糖基化等多个翻译后加工功效，因而体现产物在分子构造、理化特性和生物学功效方面最靠近于天然的高等生物蛋白质分子。体现宿主：哺乳动物细胞体现外源蛋白最初是将抗体基因重新导人淋巴细胞中由病毒(如SV40)或lgG的启动子增强子引导。产生的抗体含有对应的结合能力和数应功效，但体现量很低。惯用的非淋巴细胞类有中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、非洲绿猴肾（COS）细胞、人类肾细胞（293）、幼仓鼠肾细胞（BHK）等。不同宿主体现的重组蛋白其稳定性和翻译后修饰有所不同，需根据目的蛋白选择最佳的宿主细胞。CHO细胞是现在较惯用的哺乳动物宿主细胞，被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞（GRAS），广泛应用于医疗用重组蛋白的生产。它遗传背景清晰，生理代谢稳定，与人的亲缘关系靠近，外源蛋白修饰精确，基因转移和载体体现系统完善，对剪切力的耐受性好，便于大规模培养，并且能在无血清和蛋白培养基中生长。缺点是产率较低，重组蛋白普通仅占细胞总蛋白的%。CHO细胞有多个亚细胞株，如脯氨酸缺点型CHO-K1、紫外线敏感型UV20、UV41，二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)CHO和转入了胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因、更加适应无血清培养基的超级CHO等。COS细胞是进行外源基因瞬时体现时最惯用的宿主，源于1-1细胞株，基因组内含有腺病毒SV40的T抗原基因，允许SV40进行裂解生长，允许SV40早期突变体的复制。COS细胞载体易于构建，便于使用，并且对插入DNA的量或者采用基因组DNA序列的状况都没有什么限制，能够通过检测体现状况来确证cDNA的阳性克隆，也利于快速分析引入克隆化cDNA序列中的突变。来源于MadIin-Darby犬肾的高分化内皮细胞株(MDCK)，悬浮培养时重组蛋白产率能够达成细胞总蛋白量的20％，在细胞单层贴壁培养状况下体现量也可达成10mg/L。在多个肾细胞获得成功后，人源肾脏细胞293细胞也通过改造成为惯用的体现宿主。293细胞株整合了人类腺病毒5DNA的片段，明显强化了宿主的部分启动子，使得重组蛋白能够达成较高的体现量。293细胞能在无血清培养基中生长，其变种有快速生长型293-F、整合了猴腺病毒大T抗原的293-FT、融合了腺病毒部分基因的AD293和HEK293、贴壁好适宜锚定筛选的293-H等。体现载体与酵母和昆虫细胞类似，哺乳动物细胞体现外源重组蛋白也能够运用质粒转染和病毒载体的感染。病毒载体哺乳动物可用的病毒载体诸多，有猿猴空泡病毒（SV40）、腺病毒（Adenovirus）、腺有关病毒（Adeno-associatedvirus）、人牛痘病毒（Vacciniavirus）、杆状病毒（Baculovirus）、冠状病毒（Coronavirus）、埃-巴二氏病毒（Epstein-Barrvirus）、单纯疱疹病毒（Herpessimplexvirus）、慢病毒（Lentiviruses）、脊髓灰质炎病毒（Poliovirus）、逆转录病毒（Retroviruses）、塞姆利基森林病毒（SemlikiForestvirus）等。不同的病毒载体能够裂解增殖或复制的宿主各不相似，应根据需要选择。腺病毒（Adenovirus）：腺病毒为线状双链DNA病毒，基因组长36kb，DNA两端各有一种反向重复序列ITR。腺病毒宿主范畴广，可感染一系列哺乳动物细胞，其中人源细胞是腺病毒的允许细胞，腺病毒能够完毕复制增殖裂解宿主的周期，不会插入人源细胞基因组中，因而不会致癌；而对啮齿动物，大部分腺病毒都能够致癌。腺病毒基因按转录时间的先后，能够分为早期（E1-E4）和晚期转录单位（L1-L5）。E1蛋白调节细胞代谢并激活其它早期基因的启动子，E2启动病毒DNA复制，E3与病毒复制无关，重要协助病毒的成熟，E4重要与病毒mRNA的代谢有关。pAdEasy-1载体以人腺病毒AD5基因组为蓝本，敲除了E1和E3，扩大载体容量的同时，使病毒不能在非允许细胞中复制。目的基因首先克隆在一种带有ITR和筛选标记的穿梭质粒（如pShuttle-CMV）中，线性化后与pAdEasy共转染大肠杆菌，以抗生素筛选带有重组病毒的原核宿主，提取纯化后在融合有腺病毒E1基因的293细胞株（如AD293）中增殖和体现。重组病毒中，体现盒插入在腺病毒E1区，使用E1强启动子体现重组蛋白。使用人源细胞株作为体现宿主时，腺病毒载体最后会裂解宿主，因此不适于持续体现。慢病毒（Lentivirus）：慢病毒是逆转录病毒的一种，由潜伏期较长而得名。慢病毒既能够转染处在有丝分裂活跃期的细胞，又能够转染分裂缓慢及处在分裂终末期的细胞，涉及造血干细胞，神经干细胞，处在分化终末的神经元，肝实质细胞等。根据其来源不同，慢病毒能够分为下列几类：HIVI型、HIVII型、猿类免疫缺点病毒、猫免疫缺点病毒。其中HIVI型是现在最惯用的慢病毒载体。慢病毒感染宿主细胞后立即形成前病毒，前病毒的重要基因编码区为5’LTR-Ψ-gag-pro-pol-env-3’LTR，其中LTR为长末端重复序列、Ψ为整合信号，gag基因编码病毒的核心蛋白，pol基因编码病毒复制所需的酶类，env基因编码病毒的包膜糖蛋白，pro基因则编码切割蛋白前体所需的蛋白酶。HIV-I载体系统由辅助和载体两个质粒构成。载体质粒含有整合信号Ψ、启动子、多克隆位点以及包装、逆转录和整合所需的序列；辅助质粒则与载体互补，编码了产生病毒颗粒所必须的蛋白。将两个质粒共转化到宿主中，由于辅助质粒不含整合信号，新生成的病毒中就只有目的基因。将重组病毒感染普通体现宿主，即可进行重组蛋白的稳定体现；如感染整合了gag、pol、env基因的宿主，即可进行瞬时体现。慢病毒体现系统的一种重要缺点是：载体和辅助质粒有时会在宿主中发生同源重组，产生野生型病毒。为理解决这个问题，现在使用的体现系统将辅助质粒又分成了三个质粒，分别带有逆转录酶rev基因、gag和pol基因、以及env的替代基因VSV-G（囊口腔炎病毒外壳蛋白）。将载体系统分成4个部分增加了野生病毒生成所需的重组环节，使得HIV载体系统更加稳定；外壳蛋白的单独构建，使得人们能够通过更换病毒外壳蛋白质粒来方便的更换宿主种类。单质粒体现载体觉得例，它是一种不依赖病毒的载体，构成元件有人巨细胞病毒早期启动子pCMV、多克隆位点、用于真核筛选的遗传霉素抗性基因、f1和SV40复制子、polyA转录终止信号，以及原核复制子和氨苄青霉素抗性基因。载体的使用与类似的昆虫体现载体相似：将目的基因克隆入载体中，在原核宿主中扩增纯化，转染真核体现宿主，使用G418筛选高体现细胞株。载体很小（），易于操作，宿主溶源SV40病毒时能够独立于染色体自主复制；但是其体现流程复杂，对质粒载体纯度和转染效率规定很高，筛选工作费时费力，并且体现盒的插入位点和拷贝数不可控制，可能影响宿主生理性质。使用Flp-In宿主细胞株能够克服这些缺点。图5：A：Flp-InCHO细胞系；B：pEF/FRT/V5-DEST质粒图谱惯用的哺乳动物细胞株，如CHO、293等都能够改造为Flp-In细胞株。序列SV40启动子—ATG—FRT—lacZ-Zeocin整合在基因组中活跃体现的区域（图5A），使用博来霉素筛选宿主基因型，带有外源基因的体现盒插入FRT位点，确保了目的基因的对的整合。使用Flp-In细胞株必须配合体现pOG44质粒和带有FRT重组序列的体现载体，如pEF/FRT/V5-DEST（图5B）。pOG44带有编码了Flp重组酶的基因，将其与体现载体共转染，Flp重组酶协助体现盒插入宿主染色体的FRT位点，即可获得稳定体现重组蛋白的细胞株。除以上介绍的两种载体外，尚有多个单质粒载体可供选择（表9）。载体启动子融合标签筛选标记其它V5-DESTCMVV5新霉素带有TEV蛋白酶切位点V5-DESTCMVV5新霉素V5-DESTCMVV5灭瘟素GFP-DESTCMVGFP灭瘟素pcDNA-DEST40CMVV5,His新霉素pcDNA-DEST47CMVGFP新霉素pcDNA-DEST53CMVGFP新霉素pDEST26CMVHis新霉素pDEST27CMVGST新霉素pEF-DEST51hEF-1αV5,His灭瘟素pEF/FRT/V5-DESThEF-1αV5潮霉素带有FRT重组序列表9：惯用哺乳动物单质粒体现载体，新霉素是遗传霉素类似物，也可用G418筛选四环素诱导体现系统：四环素诱导体现载体是基于大肠杆菌四环素操纵子而设计的。大肠杆菌中，四环素抗性蛋白（TetR）调控着Tn10转座子上的四环素抗性操纵子。TetR结合在tet操纵序列（tetO）上，克制下游基因的转录。当环境中存在四环素时，四环素结合在TetR上，使其构象发生变化，从DNA上脱落而解除克制。TetR和tetO为哺乳动物四环素诱导体现系统提供了调控与诱导体现的基础。哺乳四环素诱导体现系统有两种：Tet-On和Tet-Off（图6）。Tet-On系统在培养基中添加Dox（四环素类似物）时诱导外源基因体现；Tet-O