实验一 大豆叶片DNA提取(CTAB)

实验一大豆叶片DNA提取（CTAB）一、实验目的学习掌握从植物中提取DNA的方法；学习掌握从CTAB法提取植物DNA原理、方法及过程。二、实验原理（CTAB）大豆DNA提取的方法很多，如提取质量高，得率较低的CTAB（溴化十六烷三甲基铵）法；提取得率高，质量较好的SDS（十二烷基磺酸钠）法；用于少量提取的SarcosylCTAB,SDS，Sarcosyl都是洗涤剂性质的化学药品，主要的破膜成份，可将细胞内的物质释放出来。大豆DNA提取所用的材料可以是种子、幼苗或叶片、根系、茎等各部分组织。在分子生物学上常用的材料是叶片，转基因检测或进口大豆检测时常用到子粒。利用叶片作为提取材料时，若在田间种植材料，并做其它特性鉴定的情况下，多是在长出3〜5片三片复叶时，取上部嫩叶，选用较嫩的叶片材料才可能显著提高提取的DNA浓度。但要保留生长点；若种植材料只是为取叶片提取DNA时，可在室内用营养钵种植，长出足够嫩叶即可取叶片。抽提DNA中主要杂质为碳水化合物，同时为了减少叶绿素对提取DNA纯度和颜色的影响，在采样前将取样植株在暗室放置2〜3d，可以大大降低叶片中可溶性碳水化合物的含量，从而提高提取DNA的纯度。根据所用材料的不同而采取不同的提取方法，通常对于叶片DNA的提取采用SDS法，而大豆子粒或大豆粉采用CTAB法效果较好。大豆DNA提取无论采取传统的CTAB法、SDS法还是采用现在所改良的一些方法，其步骤有繁有简，但归纳起来都要进行以下5个方面工作：破壁、破膜、抽提、沉淀和溶解。各提取方法有一些差异，但原理一致。破壁（破坏细胞壁）植物DNA提取与动物不同，植物细胞与组织具有较硬的细胞壁，大量酚类、色素、多糖、单宁等物质，给DNA的提取与纯化带来许多困难。所以提取时必须先破坏细胞壁。用叶片作为材料破壁的方法最常用的是液氮研磨法，尽量取鲜嫩叶片，放入研钵，加入液氮研磨，一般要加入3〜4次液氮。研磨好的特征是叶片粉末颜色由绿变白。如果研磨样品量非常少（如转基因植株检测），可将叶片放入1.50mL的Eppendorf离心管，将离心管放入液氮中，用塑料杆头的电钻研磨，效果较好。一些实验室有使用玻璃匀浆器的，但效果不是很好。破膜（破坏细胞膜，释放细胞内物质）破膜的主要成份是去污剂，如上面所列举的CTAB、SDS、Sarcosyl等。还有Tris・Cl、EDTA、NaCl等成份。Tris・Cl是缓冲液，提供一个pH值稳定的环境；EDTA可以螯合金属离子，而某些金属离子对酶类的活性是至关重要的，如Mg2+。如果酶不能与金属离子结合，酶就失去了活性，核酸酶类也是如此，所以EDTA可避免提取DNA时核酸酶类污染，造成DNA的降解;NaCl可以提供一个高盐的环境，为进一步去除蛋白质所必需的。而lmol・L-的NaCl浓度是大豆新鲜叶片快速分离DNA的理想条件。DNA提取液要特别注意pH值，因为在偏酸的条件下，RNA稳定，而DNA不稳定，在偏碱的条件下，DNA稳定，而RNA不稳定，因而DNA提取液pH值应在&0左右，pH值的调节应重点放在EDTA溶液的配制上。抽提（去掉蛋白质及其它杂质）抽提的主要目的是去除蛋白质。去除蛋白质的试剂主要是苯酚和氯仿。苯酚应使用pH值为&0的Tris饱和酚，碱性环境可以保证DNA不被降解，因而不能使用pH值为5.0的水饱和酚。苯酚去除蛋白质的效果比较好，但苯酚与水相溶，二者不分层，不能很好地去除苯酚，而苯酚长时间存在会导致DNA降解。为了避免这种情况发生，常常用酚仿试剂，即苯酚：氯仿：异戊醇为25：24：1的混合液。氯仿也有抽提蛋白质的作用，但效果不是太好。苯酚在氯仿中的溶解度比在水中的溶解度高，因而苯酚更易溶于氯仿中。氯仿与水不溶，二者分为两相，即会出现分层现象。通过离心，可以使分层更为彻底，从而除掉苯酚及氯仿。异戊醇主要是减少抽提过程中翻转产生的泡沫，达到较好的抽提效果。也有人采用氯仿—异戊醇代替酚抽提，由于氯仿—异戊醇易溶于异丙醇，并易于挥发，由此克服了由于酚等的残留带来的DNA降解及酶切上的困难。沉淀(沉淀DNA)沉淀常用试剂为异丙醇和乙醇。大量DNA提取时，一般用预冷(-20°C)的异丙醇进行沉淀，即根据DNA抽提后得到上清液的体积加入等体积预冷的异丙醇。有人在抽提前和抽提后分别用异丙醇进行沉淀，DNA得率提高。这是因为用异丙醇反复沉淀，有利于特异性地沉淀核酸，提高核酸的产量。总的来讲，用异丙醇沉淀DNA的效果较好，但也有一个突出的缺点，就是异丙醇不容易挥发出去，这对后期DNA溶解有不良影响。无水乙醇的沉淀效果没有异丙醇好，沉淀时往往加入量大，即根据DNA抽提后得到上清液体积加入二倍体积的无水乙醇。无水乙醇的优点是易挥发，容易去除。为了解决这些矛盾，实验中常常先用异丙醇沉淀DNA，再用70%酒精清洗，这样70%洒精就可将异丙醇溶解出来，而酒精又可挥发出去。因此在精提DNA时，常只用无水乙醇沉淀，而不用异丙醇。沉淀要注意的另外一个问题是，当将抽提后的上清液加入异丙醇或乙醇时，不应太急，要缓缓地旋转地加入，而且沉淀时要避免上下颠倒，以免导致DNA降解。溶解(溶解DNA)溶解DNA一般采用两种方法。一种方法是用超纯水溶解，另一种是用TE缓冲溶液溶解。用超纯水溶解不利于DNA的长期保存，因为在水中DNA双链不很稳定，易降解。其优点是可以直接用于各种生物技术操作。TE缓冲溶液中含有Tris・Cl和EDTA，可以维持DNA双链的稳定性。EDTA是金属离子的螯合剂，可防止各种核酸酶的酶解，但也会抑制实验中各种酶的活性，影响实验结果，所以TE缓冲溶液溶解的DNA在使用时需要沉淀，用超纯水重新溶解。因此，DNA长期保存时，应用TE缓冲溶液溶解；而DNA提取后立即用于实验时，则应用超纯水溶解。小结对于DNA的提取，进行各种试剂和方法的研究，在不同实验条件和不同操作人员效果不同。如能遵循上述基本原理，大豆DNA的提取将得到较好结果。在DNA提取时，不能简单地按照操作步骤中的时间或离心的转速，应注意各个步骤中的典型特征是最重要的。如破壁时叶片的由绿变白，抽提时的蛋白质沉淀析出等。只有掌握这些特征，实验才能做到有的放矢，及时调整实验中的不定因素，得到好的结果。二、药品耗材100mL1M的Tris-HCl(pH=8.0)的配制：称取12.114gTris碱固体溶于80mLddH2O中，加4.2mL的质量分数为37%浓盐酸，调节酸碱度到pH值为&0后，溶液定容至100mL。200mL的质量分数为2%的CTAB提取液的配制：4g的CTAB固体,16.364g氯化钠(NaCl),1.48g固体EDTA・Na・2H20,20mL的1MTris-HCl(pH=8.0)，用ddH20定容至200mL，121C下灭菌20分钟。使用时每40mLCTAB提取液加10“L巯基乙醇。氯仿、异丙醇、异丙醇、酒精、液氮、ddH^)、移液枪头、离心管。三、仪器设备离心机、涡旋仪、移液枪、水浴锅、离心管架。四、方法步骤CTAB在65°C水浴中预热，取大豆叶片在液氮中研磨成粉末状。取200mg样品(约在离心管0.1刻度线以下)放入1.5mL离心管中，加入600pLCTAB,颠倒混匀5-6次，65C水浴15分钟。再加等体积的氯仿异戊醇(24:1)溶液轻轻摇晃30秒，在4C下12000rpm/分钟离心1分钟后，吸取上清液放置于干净的离心管中。加入同体积的预冷异丙醇溶液，充分颠倒混匀，用移液枪反复吹吸几次并重复一次，这时可见分散的絮状物，在4C下12000rpm/分钟离心2分钟后，弃上清液，保留下面沉淀。用600pL70%乙醇洗涤沉淀，用移液枪反复吹吸几次并重复一次，弃除乙醇(也可以低速离心1-2分钟)，在室温下将离心管倒置于吸水纸上晾干。沉淀用TE溶液溶解DNA，再加入RNase至终浓度50pg/mL，在37C下保温半小时，将DNA样品放入冰箱长期保存。短期保存可直接用超纯水溶解放在-20C下保存。五、实验注意事项DNA二级结构易''变性”。DNA的二级结构和双链易受多种因素(如强酸、强碱、加热、低盐浓度、有机溶剂、酰胺类、尿素等)的影响引起双链解开，即“变性”，因此抽提时避免使用变性的条件。抑制内外源DNase的活力。DNase就象一把刀，它能把大分子的DNA切成碎片，所以要加以杜绝，现可以通过多种途径来做到这一点：、低温操作；b、调节pH,使偏碱(pH8.0)；c、抽提液中加表面活性剂；d、加螯合剂(EDTA)除去酶的铺助因子(Mg2+),使酶活性丧失。防止化学降解。如过酸或过碱以及其它化学因素，会使DNA降解，一般综合考虑，取pH8.0左右为宜。防止物理因素降解。如温度太高或机械张力剪切等，DNA分子特别大，其分子量可达1012道尔顿，极易被机械张力拉断，甚至在细管中稍急一些的流动也会使DNA断裂，所以在抽提过程中要特别注意这一点，操作过程要尽量简便、温和、减少搅拌次数，也不要剧烈摇动。植物的次生代谢物(主要是胞质内的多酚类或色素类化合物)对核酸提取有干扰作用。因此，一般尽可能选幼嫩的、代谢旺盛的新生组织作为提取DNA的材料，这是因幼嫩的新生组织次生代谢物较少，DNA含量高，且易于破碎，植物材料最好是新鲜的。分离提取植物DNA的方法很多，本实验采用CTAB法提取DNA并通过紫外吸收法和电泳鉴定。六、思考题CTAB方法原理是什么？答：植物组织中绝大部分是核DNA，它和组蛋白、非组蛋白结合在一起，以核蛋白(即染色质或染色体)的形式存在于细胞核内。CTAB是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中(0.7mol/LNaCl)是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一