第一章 组织工程学-概述

组织工程学授课人：李立华

第一章组织工程学概述第一节概论第二节组织工程学背景第三节组织工程学三要素第四节组织构建第五节组织工程重要进展自体组织移植异体组织移植人工代用品免疫排斥反应供体数量不足道德伦理制约器官移植组织工程2023/10/163TissueEngineering第一节组织工程学概论

——

应用工程学和生命科学的原理与方法，将在体外培养、扩增的功能相关的活细胞（livingcells）种植于多孔支架(scaffolds)上，细胞在支架上增殖、分化,构建生物替代物，然后将之移植到组织病损部位，达到修复、维持或改善损伤组织功能一门科学。2023/10/164TissueEngineering一、组织工程学的概念

组织工程学是集生物工程、细胞生物学、分子生物学、生物材料、生物技术、生物化学、生物力学以及临床医学于一体的一门交叉学科。2023/10/165TissueEngineering二、组织工程的背景由于移植器官来源严重的缺乏，早在一九八0年代美国麻州总医院的外科医师乔瑟夫‧韦肯逖（JosephVacanti）与麻省理工学院的化工系教授罗伯特‧蓝格（RobertLanger），便已想到或许应该像制造汽车零件般的，利用科学的方法制造人体组织与器官的零件，以克服器官捐赠来源短缺的窘境。因此他们结合了医学背景与工程材料知识携手合作，研发能修复人体病变组织与器官的零件，这就是组织工程的开始。JosephVacantiRobert

Langer6RobertLanger教授培养的长了人体耳朵组织的老鼠1992年他们研究一种能被生物体分解的多孔状结构高分子材料，并在其上培养软骨细胞。由于高分子材料的多孔状结构能让培养液与代谢物自由穿透，培养的细胞因此能着床且增生，形成新的软骨组织。他们也成功地在老鼠背上培养出人耳形状的软骨。曹谊林71987年美国国家科学基金会提出并界定组织工程为重点科技，并于次年在加州太后湖举行了第一次组织工程会议。一九九零年举办了第一届组织工程学术研讨会，而专业期刊TissueEngineering（《组织工程》

）也在一九九五年正式发行。美国与世界的组织工程学会也分别于一九九六与一九九八年正式成立，自此组织工程已成为生物技术研究领域的明星。2023/10/168TissueEngineering第二节组织工程原理1988年正式定义为：应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。2023/10/169TissueEngineering一、基本原理和方法

是将体外培养扩增的正常组织细胞吸附于一种具有优良细胞相容性并可被机体降解吸收的生物材料上形成复合物，然后将细胞——生物材料复合物植入人体组织、器官的病损部位，在作为细胞生长支架的生物材料逐渐被机体降解吸收的同时，细胞不断增殖、分化，形成新的并且其形态、功能方面与相应组织、器官一致的组织，从而达到修复创伤和重建功能的目的。2023/10/1610TissueEngineering基本原理和方法2023/10/1611TissueEngineering种子细胞生物材料组织、器官构建组织工程的临床应用二、主要研究内容核心：建立由细胞和生物材料构成的三维复合体

组织工程2023/10/1612TissueEngineering组织工程的步骤与方法将细胞取得，快速培养后再植入支架，使细胞依着支架材料的形状长出新的再生组织，最后长好的组织再移植入人体。2023/10/1613TissueEngineering种子细胞(Cell)

：增殖、分化、自组装成组织和器官信号因子(生长因子，Growthfactor)：调节细胞的增殖和分化支架材料

（scaffold）：（细胞外基质，Extracellularmatrix,ECM)，支撑和指导细胞增殖、分化2023/10/1614TissueEngineering第三节组织工程三要素一、支架材料─细胞的家想要让细胞长成我们所预期的器官构造，如果缺乏细胞的立足点，也就是作为细胞生长温床的「支架」，是一件不可能的任务。组织工程利用特殊的生物高分子材料建构出三度空间的立体框架，让植入的细胞可以在其中生长并增殖。支架的功能不仅仅当作细胞生长的框架结构，更可以进一步地控制引导细胞朝特定的方向生长、分化。2023/10/1615TissueEngineering结构支撑细胞锚点功能引导1.为什么细胞需要一个家？组织再生的关键点之一是，细胞要在何处生长及分化成我们所需的组织？一如胚胎细胞在妈妈的肚子里健康地成长茁壮，我们也必须提供一个舒适、安全的居住环境，让细胞能在里面成长，此一结构就是在组织工程中所使用的「支架」（scaffold）。我们可以把支架想象成一个房子，或是一个温室，可以将其放置在实验室或是体内，让细胞在支架中繁殖分化，形成组织，再移植进入患者身体，或者直接在患者体内繁殖分化成所需的组织。若此一支架的外型，尺寸与待修补的组织一样，则所培养出的组织将很适合修补缺陷组织，这也是组织工程重要的一环。但是，怎样才是细胞理想甜蜜的家呢？2023/10/1616TissueEngineering支架必须有许多彼此连接的孔洞的要求，以便细胞和营养液流通。这些孔洞的大小，必须要能让细胞通过。因为要让细胞附着在支架上繁衍成长，所以支架的材料必须是没有毒性，具有生物相容性，才不会伤害细胞及患者。支架的表面需适合细胞附着，才能使细胞「安居乐业」。2.理想的家？2023/10/1617TissueEngineering支架若能在细胞繁殖的期间，同时分解成对人体无害的物质。材料的选用仍须考虑适当的分解速率，以配合细胞的繁殖速率因为支架终究将移植入体内，所以必须具备一定的强度，不然整个结构可能受体内各种外力的影响而垮掉。所以，在考虑孔洞大小的时候，不可忽略整个结构的强度。理想的家？2023/10/1618TissueEngineering组织工程支架的要求符合生物安全性要求合适的可生物降解吸收性良好的生物兼容性，即没有严重的免疫排斥问题；合适的孔尺寸、高孔隙率和相连的孔形态特定的三维外形高表面积和合适的表面理化性质与植入部位组织力学性能相匹配的结构强度支架设计及制备技术材料表面工程2023/10/1619TissueEngineering无论所使用的材料为何，皆具有两个共通的特性：首先是可塑性，可按照不同的组织器官构造，塑造出我们所想要的形态；其次是支架内部的孔洞结构，它就像是一间间的小房间，细胞植入后，如同攀岩一般先贴附在房间的墙壁上，然后慢慢地往房间中央伸展，最后细胞及其制造出的细胞外基质形成组织而占满了整个房间，细胞彼此间穿墙而过形成联合的整体，长成我们所要的器官。2023/10/1620TissueEngineering2023/10/1621TissueEngineering4.细胞外基质的结构

机体中除了细胞之外还有一些非细胞物质，称为细胞外基质（ECM，extracellularmatrix）。它们是在机体的发育过程中由细胞分泌到细胞外的各种生物大分子，这些细胞外大分子在细胞周围高度水合构成的凝胶或纤维网络，它的结构精细而又复杂。细胞是通过特殊的细胞表面受体与周围的细胞外基质发生作用，将细胞骨架及细胞内信号通道与细胞外基质连接起来。2023/10/1622TissueEngineering细胞外基质的主要成分2023/10/1623TissueEngineering天然细胞外基质（ECM）成分胶原蛋白、蛋白多糖、糖胺聚糖、层连蛋白和弹性蛋白等作用

影响细胞形态 促进细胞迁移 调节细胞增殖和分化2023/10/1624TissueEngineering5.人工合成细胞基质（支架材料）天然高分子材料合成降解聚合物生物陶瓷生物复合材料2023/10/1625TissueEngineering天然高分子材料蛋白质支架胶原明胶多糖支架海藻酸盐壳聚糖透明质酸蛋白质－多糖支架2023/10/1626TissueEngineering合成聚合物材料聚丙烯酸及其衍生物聚乙二醇及其共聚物聚乙烯醇聚交酯

聚乳酸（PLA）聚（D,L-乳酸-co-乙醇酸）（PLGA）聚乙交酯（PGA）等2023/10/1627TissueEngineering二、种子细胞为避免免疫系统的排斥，一般使用需要移植组织者的细胞。将细胞以滴入或注射的方式，植入支架中。细胞所需的营养可藉由孔洞输送至细胞处，而细胞也可经由外界的各种刺激，加速成长与布满整个支架。由于使用可降解的生医材料，因此整个支架结构会慢慢地分解，配合细胞的繁殖速率，可使新生成的细胞填补分解掉的支架部分。等支架完全分解成无害的物质之后，原本支架所占有的体积也被细胞所填补，所培养的组织如同所期望的组织，所具备的功能也一样。2023/10/1628TissueEngineering支架建好了，主角上场啦！1、细胞─组织再生的关键组织工程的最终目的是让细胞在体外生长分化为功能性的组织器官，采集少量的自体细胞加以培养，在体外大规模地增殖，再运用于体内器官的修复上。因此细胞是组织工程策略能否奏效的重要功臣。细胞的类型大致上可分为两种：已分化完全的「成熟细胞」，以及具有分化成其它细胞能力的「干细胞」。虽然近几十年间，体外培养细胞的技术已有令人瞩目的进展，但仍有许多关键性的难题尚未突破。例如，如何有效地促进成熟细胞在体外的增生能力，以及细胞取得来源受限等问题，将是组织工程应用发展的一大绊脚石。29与缺损组织细胞同源的自体细胞（如应用自体软骨、皮肤、肝细胞等修复相应组织缺损）；成体干细胞（主要包括骨髓基质干细胞等具有多向分化潜能的多能干细胞及皮肤、肌肉前体细胞等具有定向分化潜能的专能干细胞）；胚胎干细胞（具有独特的高度未分化特性以及所具有的发育全能性，即在适当条件下可以在体外培养增殖而不改变进一步形成全身各种组织器官的能力）。2.种子细胞主要有三个来源：2023/10/1630TissueEngineering胚胎干细胞胚胎干细胞是指由胚胎内细胞团(innercellmass，ICM)或原始生殖细胞(primordialgermcell，PGC)经体外抑制培养而筛选出的细胞。胚胎干细胞还可以利用体细胞核转移(somaticcellnucleartransfer，SCNT)技术来获得。胚胎干细胞具有发育全能性，在理论上可以诱导分化为机体中所有种类的细胞；胚胎干细胞在体外可以大量扩增、筛选、冻存和复苏而不会丧失其原有的特性。2023/10/1631TissueEngineering成体干细胞成体干细胞是指存在于一种已经分化组织中的未分化细胞，这种细胞能够自我更新并且能够特化形成组成该类型组织的细胞。成体干细胞存在于机体的各种组织器官中。成年个体组织中的成体干细胞在正常情况下大多处于休眠状态，在病理状态或在外因诱导下可以表现出不同程度的再生和更新能力。2023/10/1632TissueEngineering3.干细胞研究中的主要问题维持胚胎干细胞未分化状态的机制干细胞定向诱导分化的调控机制获得高数量和高纯度的分化细胞，为组织工程提供种子细胞人胚胎干细胞可以形成各种类型的细胞和简单的组织，但是否具有形成复杂器官?移植排斥问题干细胞用于临床治疗的安全性问题干细胞可塑性的机制是怎样的2023/10/1633TissueEngineering

山中伸弥（

ShinyaYamanaka）京都大学物质-细胞统合系统据点iPS细胞研究中心主任，诱导多能干细胞研究

约翰·伯特兰·格登爵士（SirJohnBertrandGurdon）英国剑桥大学教授，发育生物学家，细胞核重新编程研究

人们认为未成熟细胞发展成特定成熟细胞是单向性的，不可能再恢复到多功能干细胞的阶段。然而，格登和山中伸弥教授发现，成熟的、专门的细胞可以重新编程，成为未成熟的细胞，并进而发育成人体的所有组织。4.三位科学家介绍2012诺贝尔生理或医学奖15岁的约翰·格登在伊顿公学(Eton)求学时，数学、物理和生物的成绩排名都是靠后的，尤其是生物，在250名学生中排名倒数第一，因此他曾被同学讥讽是蠢蛋。约翰·戈登（JohnGurdon）IbelieveGurdonhasideasaboutbecomingascientist;onhispresentshowingthisisquiteridiculous;ifhecan’tlearnsimplebiologicalfactshewouldhavenochanceofdoingtheworkofaspecialist,anditwouldbeasheerwasteoftime,bothonhispartandofthosewhowouldhavetoteachhim当遇到麻烦，比如实验不成功，我就看看这个报告，提醒自己也许不擅长这个工作。但我要努力，否则真的被老师说中了。——约翰·格登中山伸弥反其道而行之——不是让胚胎干细胞变成什么，而是让别的东西变成胚胎干细胞。2014年1月28日，日本理化学研究所一名30岁的女研究员小保方晴子发明了比ｉＰＳ细胞更简单快速安全的外部刺激生成万能细胞（STAP干细胞）的方法，论文在英国《nature》杂志上发表引起了全世界的注目。2009年从早稻田大学硕士毕业后，去了美国哈佛大学医学院留学并从事研究，当时就通过实验得到了万能细胞的结果，但是由于数据不够充分，被周围的美国同事嘲笑是不是搞错了，小保方为此哭了好几天，回到日本后就职于理化学研究所继续细胞实验，甚至洗澡时约会时都想着实验的事情，终于获得了成功并将成果公布于世三、生长因子──所罗门之钥如果单单只靠支架及细胞的配合，要想完成组织再生的艰巨任务，可说是[万事具备，只欠东风]。唯有合适的讯息因子加入，才能诱导细胞在支架材料上正确地分化、迁移及生长，最后才有功能性正常的组织器官诞生。不同的细胞类型，施以相当的讯息因子，才能够启动组织再生的过程。2023/10/1639TissueEngineering生长因子指的是什么呢？帮助细胞黏贴在支架上的贴附因子促进细胞正常生长的生长因子引导干细胞分化为想要的细胞分化因子2023/10/1640TissueEngineering根据种子细胞接种途径与组织形成环境的不同，组织工程化组织构建主要有三种形式：体内构建体外构建原位组织构建第四节组织构建——

组织工程研究的核心2023/10/1641TissueEngineering——指种子细胞与生物材料复合后，组织尚未完全“成熟”时就植入体内，组织形成与生物材料降解在体内完成。体内组织工程化组织构建，植入时因组织尚未完全形成而生物支架存在较多的孔隙，有利于周围组织液与营养物的渗入，也有利于血管的长入；但因细胞外基质成分较少，细胞直接暴露于周围环境抗感染能力差，因此，对植入部位创面要求较高。2023/10/1642TissueEngineering一、体内构建体外构建：——即在体外模拟体内环境，应用生物反应器形成组织与器官。组织工程生物反应器——是指模拟体内组织形成或存活时的生物化学与生物力学等生理环境，进行细胞培养与组织构建的体外培养装置与系统。2023/10/1643TissueEngineering二、体外构建原位组织构建：——单纯植入生物材料支架于体内组织缺损部位，依靠周围组织细胞迁移并粘附于生物材料支架形成并再生组织，这种方式并非经典的组织工程概念，只适用于较小的组织缺损修复。2023/10/1644TissueEngineering三、原位组织构建四、主要研究领域：（1）代谢性组织/器官的构建：结构复杂并具有不同代谢功能器官的组织构建研究，如肝脏、肾脏、心脏等复杂器官的组织构建；（2）结构性组织/器官的构建：结构较为简单不执行或仅执行简单代谢功能的结构性组织的组织工程化构建研究，如骨、软骨、肌腱、神经等组织的构建。2023/10/1645TissueEngineering

五、组织构建成果Invitroeng-earFemurArticularcartilageMeniscusTracheaTendonTMjointSkinCorneastromaCorneaepitheliumVesselNerve2023/10/1646TissueEngineering动物体内已成功构建出组织工程化组织与器官

免疫缺陷小动物—>免疫功能完全大型哺乳动物构建并修复单一组织组织—>复合组织构建与修复组织工程化组织—>复杂生命器官组织构建并修复动物的体内构建与修复—>相继初步应用于临床上并显示出肯定的效用检测方法、评定标准及安全性长期评价组织工程产品——批量生产、包装、贮存、运输、复苏及长期检测技术真正走向临床，尚有大量基本科学问题需阐明2023/10/1647TissueEngineering第五节组织工程重要进展一、组织工程骨组织构建2023/10/1648TissueEngineering每年643,000例患者需植骨（美国）医疗消耗60亿美元目前治疗45%自体骨移植45%异体骨移植10%人工骨移植50%移植效果不理想骨缺损治疗现状2023/10/1649TissueEngineering1、人工骨的支架材料功能人的骨头在人体中起一支撑人体重量，维持人体力学平衡的功能，因此，人工骨的组织工程支架材料必须具备以下两个功能。（1）有一定机械强度以支撑组织的高强度材料，以保证材料植入人体后，有支撑体的重量，不改变骨骼形状。（2）有一定生物活性可诱导细胞生长、分化，并可被人体降解吸收。在组织工程出现以前的第一种功能的材料为非降解性材料，仅起到支撑固定的作用。存在的一个问题是：在骨头愈合后，必须进行第二次手术取出这种材料。2023/10/1650TissueEngineering

第二种功能的材料主要是给细胞提供三维生长空间，其本身具有生活性，可诱导细胞分化生长和血管的长入，以形成活的骨组织，使其具有人骨的功能和作用。以上两方面对骨支架材料要求的条件可以归结为：组织工程支架材料是具有一定强度并具有生物活性的可降解材料。

2023/10/1651TissueEngineering山羊组织工程骨修复胫骨三年后随访术后3年大体外观3年后随访髓腔再通3年后血管铸型标本2023/10/1652TissueEngineeringTheMRIimagesofn