酪蛋白钠灌注量对乳蛋白合成的影响

酪蛋白钠灌注量对乳蛋白合成的影响

日粮氨基酸平衡会影响牛奶蛋白的合成。许多实验表明，在日粮中添加强制性氨基酸可以提高祖母的乳液水平，以及日粮中的蛋白质和其他养分的效率。通常以小肠可消化氨基酸的构成与乳蛋白氨基酸构成的接近程度评价泌乳反刍动物日粮氨基酸平衡状况,然而这种方法缺少可靠的理论依据。消化道是动物体内代谢最为活跃的体组织,门静脉回流内脏组织(PDV,包括消化道、脾脏和胰脏)重量约占体重的3%～6%,但却占全身蛋白质周转量、能量和心输出量的20%～35%。Lobley等的测定结果表明,若将绵羊PDV组织由动脉吸收的氨基酸换算为蛋白质当量,则PDV组织利用的氨基酸数量约相当于全身蛋白质流量的23%。因此,经过消化道的代谢,吸收进入门静脉的氨基酸构成可能与小肠中的构成明显不同;肝脏代谢又可能引起氨基酸构成的进一步变化;过肝脏的吸收氨基酸与静脉回流氨基酸混合进入动脉供给,此时的氨基酸构成在多大程度上能够保持小肠可吸收氨基酸的原貌值得怀疑。即使动脉氨基酸构成与小肠可消化氨基酸构成完全相同,乳腺组织对不同必需氨基酸吸收速度上可能存在差异、以及乳腺组织对必需氨基酸的需求可能不仅限于乳蛋白的合成等也对乳蛋白氨基酸构成可否作为小肠可消化氨基酸理想模式产生疑问。因此,本试验通过研究小肠可消化氨基酸供给量的变化对动脉血浆氨基酸构成、乳腺氨基酸吸收速度、乳蛋白合成效率等方面的影响,以期对以小肠可消化氨基酸构成为基础评价日粮蛋白质氨基酸平衡的可靠性进行评价。2材料和方法2.1试验羊的饲养选用4只体况良好,产奶量相近,体重(35±5)kg的2.5周岁的萨能奶山羊,安装永久性真胃瘘管,并做颈动脉游离手术。试验羊单笼饲养,采用自动喂料器每隔2h等量饲喂1次,自由饮水。试验预饲期15d。2.2颗粒料日喂量的确定试验羊通过限饲,每天喂给颗粒料1.3kg。试验日粮参照美国NRC(1981)奶山羊饲养标准和西北农林科技大学奶山羊饲养标准设计,制成颗粒料,颗粒料日喂量按满足试羊能量需要的100%和粗蛋白质的70%供给,通过真胃灌注不同数量的酪蛋白钠(33、66和99g/d)使粗蛋白质的供给量分别满足需要量的85%、100%和115%。基础日粮组成和营养成分见表1。2.3真胃结构蛋白灌注量的确定本试验采用4×4拉丁方试验设计。4个试验处理的真胃酪蛋白钠灌注量分别为0、33、66和99g/d。灌注每期7d,试验期3d,两期间隔5d。2.4血样、血流量和尿素氮的采集将试验羊放入消化代谢笼内,用自动喂料器饲喂基础日粮,试验期内饲喂量和饲养程序不变,试羊每天在08:00和18:30早晚各挤奶1次。于正试期第1天早晨08:30开始酪蛋白钠灌注,每日灌注的酪蛋白钠溶解在1200mL的蒸馏水中,水浴调温至37℃,用恒流泵(上海沪西分析仪器厂,型号HL-2)经真胃瘘管恒速注入,速度为0.83mL/min,每日连续灌注24h,连续灌注7d。正试期内每天收集奶样并准确记录其每天的产奶量,收集的奶样用于乳成份分析。正试期最后1天上下游稀释法测定乳腺血流量。染料为对氨基-马尿酸(p-aminohippuricacid,PAH)。灌注PAH工作液1h后每隔15min采血1次,连续采4次。在各采血时间点,分别同时从每只试验羊的乳静脉和颈动脉血管中抽取10mL血样,置于含有肝素(750IU)的试管中,将管放在冰中。随后,立即将采集的血液在2000r/min和4℃条件下离心15min分离出血浆,并将血浆分成2份。1份用于测定尿素氮;另1份加入等体积的10%的磺基水杨酸(SSA)溶液充分混匀后,置于-20℃冷冻30min,然后,在4℃下15000r/min离心20min沉淀血浆蛋白,取上清液保存于-20℃冰箱中,以备测定血浆中游离氨基酸。2.5指标和方法的测量2.5.1一般成分饲料中CP的测定按常规方法进行;乳蛋白由凯氏定氮法(N×6.38)测定,乳脂率由巴氏法测定。2.5.2尿素氮尿素氮试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定血浆尿素氮含量。2.5.3pah浓度的测量参照Katz等的方法比色测定。样品用氨基磺酸胺和萘乙二胺盐酸盐显色后在540nm比色测定PAH浓度。2.5.4氨基酸氨基酸分析用日立835-50氨基酸自动分析仪进行分析测定。2.6计算方法2.6.1pahmv和paha的浓度式中,I为乳腺静脉PAH灌注速度(mg/min);PAHmv和PAHa分别为PAH在乳腺静脉和颈动脉血浆中的浓度(mg/mL);MPF(M)为单位时间内乳腺静脉的血浆流量(mL/min)。2.6.2游离氨基酸吸收量式中,Uptake(M)为单位时间内乳腺组织对血浆中游离氨基酸(PFAA)的吸收量(mg/min);CMV、CA为PFAA在乳腺静脉和颈动脉血浆中的浓度(mg/mL)。2.6.3组织对血浆中游离氨基pfaa的提取式中,Extraction(M)为乳腺组织对血浆中游离氨基(PFAA)的提取率(%);CMV、CA为PFAA在乳腺静脉和颈动脉血浆中的浓度(mg/mL)。2.6.4组织血浆游离氨基酸吸收量式中,U/S为乳腺组织吸收/分泌氨基酸的比率;T为乳腺组织分泌100mL乳所需要的时间(min);Uptake(M)为单位时间内乳腺组织血浆游离氨基酸(PFAA)吸收量(mg/min);AA为100mL乳中游离氨基酸的含量(mg)。2.7不同处理的程序试验数据采用SPSS软件包(SPSSforWindows,Release11.0)中的One-Way-ANOVA程序按拉丁方设计进行方差分析,不同处理的差异显著性采用Duncan氏法进行比较。3结果3.1钠灌注对产奶量、乳蛋白率和乳脂率的影响真胃酪蛋白钠灌注水平对奶山羊泌乳性能的影响见表2。经方差分析,真胃酪蛋白钠灌注显著提高了产奶量、乳蛋白产量和乳脂产量(P<0.05),但乳蛋白率、乳脂率没有明显变化(P>0.05)。各酪蛋白灌注组间的产奶量、乳蛋白产量和乳脂产量的差异不显著(P<0.05),有随酪蛋白钠灌注量升高而升高的趋势。3.2膜蛋白钠灌注前后乳房组织表面流变性的比较真胃酪蛋白钠灌注水平对乳腺组织血浆流量和血浆流量/产奶量的影响见表3。经方差分析,各处理组间乳腺血浆流量差异不显著(P>0.05),但各酪蛋白钠灌注组每kg泌乳流经乳腺的血浆流量显著低于对照组(P<0.05),不同酪蛋白钠灌注水平组间的乳腺组织的血浆流量/产奶量差异不显著(P>0.05)。3.3u3000动脉血浆中pahs的变化真胃酪蛋白钠灌注水平对动脉血浆游离氨基酸和尿素氮浓度的影响见表4。经方差分析,除Arg(P>0.05)外,各处理间动脉血浆其他游离必需氨基酸(EAA)差异显著(P<0.05),呈随真胃酪蛋白钠灌注水平的升高而升高的趋势。动脉血浆各游离EAA浓度随酪蛋白钠灌注量增加而提高的幅度不同,99g/(d·只)酪蛋白钠灌注组与未灌注酪蛋白钠的对照组比较,动脉血浆中的Val、Ile、Leu和Lys的含量增加了2倍左右,Met、Arg、Thr、Phe和His分别增加了58.33%、11.64%、32.5%、29.87%和61.66%。真胃灌注酪蛋白钠改变了动脉血浆的必需氨基酸构成(表5),以酪蛋白钠灌注前后颈动脉血浆中浓度未发生明显改变的Arg为100,99g/(d·只)酪蛋白钠灌注组与未灌注酪蛋白钠的对照组比较,Thr、Phe、Met和His的比例变化不大,Val、Lys、Leu和Ile的比例增加了2倍左右。动脉血浆中Pro、Glu和Tyr的浓度在处理间差异显著(P<0.05),在灌注酪蛋白钠后增加;动脉血浆中Gly的浓度在灌注酪蛋白钠后出现了明显下降(P<0.05),其他非必需氨基酸(NEAA)的浓度处理间差异不显著(P>0.05)。酪蛋白钠灌注显著提高了动脉血浆中尿素氮的浓度(P<0.05)。3.4hcl对小鼠血清中氨基酸乳腺癌组织吸收速度的影响真胃灌注不同水平酪蛋白钠对乳腺组织氨基酸吸收速度的影响见表5。Thr和Ala乳腺组织吸收速度的组间差异不显著(P>0.05),其他14种氨基酸的乳腺组织吸收速度的组间差异显著(P<0.05),呈随着酪蛋白钠灌注量的增加而提高的趋势。各处理组间16种氨基酸乳腺组织吸收速度的排列次序大致相似。9种必需氨基酸乳腺组织吸收速度的排列次序是Lys、Leu、Arg>Val、Phe、Ile>Met、His>Thr;7种非必需氨基酸乳腺组织吸收速度的排列次序是Glu>Pro、Ala>Tyr、Ser、Asp>Gly。0g/(d·只)酪蛋白钠灌注组各种氨基酸乳腺组织吸收速度的变化范围是-0.21～0.93mmol/h,33g/(d·只)组的变化范围是0.05～1.83mmol/h,66g/(d·只)组的变化范围为0.06～1.96mmol/h,99g/(d·只)组的变化范围为0.10～2.07mmol/h。3.5个对eaa和非方造造型的乳腺癌组织分析真胃灌注不同水平酪蛋白钠对乳腺组织氨基酸提取率的影响见表6。经方差分析,9种EAA中,Arg和Phe乳腺组织吸收率的组间差异显著(P<0.05),其中Met乳腺组织吸收率的组间差异显著(P<0.05),呈随酪蛋白钠灌注量的增加而提高的趋势,其他EAA乳腺组织提取率的组间差异不显著(P>0.05);7种NEAA中Asp、Ser、Gly、Ala和Tyr的乳腺组织提取率组间差异显著(P<0.05),呈随酪蛋白钠灌注量的增加而提高的趋势,其他NEAA乳腺组织提取率的组间差异不显著(P>0.05)。4个处理组EAA乳腺组织提取率的排列次序均以Met最高,Val最低,Lys的乳腺组织提取率分布在第2～3位,Phe分布在第2～4位,Leu分布在第2～6位,Thr分布在第4～8位,His分布在第4～7位,Arg分布在第5～8位,Ile分布在第6～8位。NEEA中,Gly的乳腺组织吸收率在4个处理组中均为最低,Glu的乳腺组织吸收率分布在第1～3位,Ala分布在1～3位,Asp分布在1～6位,Ser分布在2～5位,Pro分布在3～5位,Tyr分布在5～6位。0g/(d·只)酪蛋白钠灌注组各种氨基酸乳腺组织提取率变化范围是-3.19%～33.89%,33g/(d·只)组的变化范围是0.81%～43.12%,66g/(d·只)组的变化范围为1.24%～44.83%,99g/(d·只)组的变化范围为1.76%～48.71%。3.6u/s及trt-pcr对eaa乳蛋白的吸收真胃灌注不同水平酪蛋白钠时,乳腺组织吸收氨基酸量/乳中分泌氨基酸量的比值见表7。除Thr、His2种EAA和Ala1种NEAA的U/S未随酪蛋白钠灌注显著提高外(P>0.05),其他氨基酸的U/S均随酪蛋白灌注显著提高(P>0.05),其中Ile、Arg、Ser、Glu、Tyr和Pro的组间差异达到极显著水平(P<0.01)。4个处理条件下,EAA的U/S均以Arg最高,Thr最低。9种EAA在4个处理间的U/S分布范围:Arg为2.26～4.78,Lys为1.14～2.42,Val为0.99～2.21,Ile为1.05～2.12,Leu为0.56～1.60,Phe为0.79～1.32,Met为0.79～1.67,His为1.11～1.40,Thr为0.42～0.33。根据9种必需氨基酸的U/S及U/S随酪蛋白钠灌注量提高的变化,可分为4类。其中Arg、Lys、Val、Ile四种EAA即使在日粮粗蛋白质供给量仅满足需要量70%的情况下(0g/(d·只)酪蛋白灌注组),其乳腺组织的吸收量也高于或接近从乳蛋白中分泌的数量,并且其U/S随着酪蛋白钠灌注量的提高而提高,说明乳腺组织对这4种EAA的乳蛋白利用效率较低,一般情况下乳腺组织从动脉吸收的4种EAA的游离形式氨基酸均超过或接近乳蛋白合成的需要量;Leu、Phe和Met3种EAA在日粮蛋白质供给量不足时,其乳腺组织吸收量低于从乳蛋白分泌的数量,随着酪蛋白钠灌注量的增加,其U/S提高,乳腺组织吸收量高于乳蛋白分泌量,说明这3种EAA的乳腺组织利用效率与供给量有关,随着供给量的提高,其利用效率降低;His的U/S组间差异不显著,且略高于1,其乳腺组织吸收量可能受到较精确的控制,以乳蛋白合成的需要量控制其吸收量;Thr的U/S组间差异也不显著,但均小于0.5,说明乳腺组织吸收的游离Thr数量不能满足乳蛋白合成的需要,用于乳蛋白合成的Thr可能还有其他来源。在6种NEAA中,Ala是唯一U/S组间差异不显著,且在1左右的氨基酸,说明乳蛋白合成所需的Ala主要来自乳腺组织对动脉血浆游离Ala的吸收,且其吸收量决定于乳蛋白合成的需要量。其他NEAA的U/S均随酪蛋白灌注量的增加而升高,但4种处理下均低于1,说明乳腺组织从动脉吸收的游离NEAA数量一般不能满足乳蛋白合成的需要,这与大多数EAA在高酪蛋白钠灌注量下的U/S高于1不同,是乳腺组织对吸收游离EAA和NEAA利用上的区别。在除Ala之外的6种NEAA中,Tyr、Ser、Pro、Gly的U/S较高,乳蛋白中的这些氨基酸主要来自吸收的动脉吸收游离氨基酸,而Gly和Asp的U/S很低,乳蛋白中的这2种氨基酸主要来自其他途径。4讨论4.1对乳蛋白产量的影响乳蛋白的合成受到日粮粗蛋白质水平、蛋白质瘤胃降解率、氨基酸平衡、能量水平和泌乳阶段等多种因素的复杂影响,酪蛋白钠灌注试验得到的不同观察结果往往与试验条件的差异有关。Guinard等由十二指肠给奶牛灌注酪蛋白钠,观察到奶牛乳蛋白的产量提高。Choung等给奶牛灌注酪蛋白钠未引起乳蛋白产量的明显变化,分析可能与日粮中能量水平限制有关。Clark给奶牛灌注酪蛋白钠也未引起乳蛋白产量的明显升高。本试验在基础日粮蛋白质供应不足的情况下,真胃灌注酪蛋白钠使奶山羊的产奶量、乳蛋白产量和乳脂产量均明显升高(P<0.01),但乳蛋白率和乳脂率未出现明显变化(P>0.05)。4.2血浆流量与产奶量的比率Davis等在试验中观察到,给奶牛灌注酪蛋白提高了产奶量并使乳腺组织的血流量升高,表明乳腺组织血流量升高是引起产奶量升高的因素之一。而在本试验中并未观察到真胃酪蛋白钠灌注引起乳腺组织血流量的明显变化(P>0.05),由于酪蛋白钠灌注使奶山羊的产奶量提高,结果导致血浆流量与产奶量的比率下降了14.41%(P<0.05)。这与Guinard等的试验结果相一致;由于乳腺组织可以由提高对动脉血液营养物质的吸收率或通过提高乳腺组织的血流量来获得产奶量升高后对营养物质需要量的增加,在产奶量升高幅度不大的情况下,对营养物质需要量的增加可能只需要提高血液营养物质的吸收率即可实现,不需要明显提高血流量,而当产奶量升高幅度较大时才必须由血流量的明显升高来增加对乳腺组织的营养物质的供应。同时由于血流量测量的误差较大,在血流量升高幅度不大时,测量误差有可能掩盖了处理效应。以上两方面的原因可能导致了不同试验观察结果的差异。4.3膜下动脉血浆中na、njh、na的变化动脉血液中的游离氨基酸分别来自消化道吸收、体组织蛋白的分解和静脉回流,并且吸收自消化道的氨基酸在到达动脉血液之前经过了消化道组织和肝脏的代谢,由此使动脉游离氨基酸的构成与消化道可消化氨基酸构成的差别。由于合成乳蛋白的游离氨基酸是从动脉血液中吸收而来的,因此研究消化道氨基酸构成与动脉血液氨基酸构成的关系,有助于更加准确地确定消化道理想氨基酸构成。在本研究测定的9种EAA中,Arg是唯一动脉血浆浓度未因酪蛋白灌注而明显升高的氨基酸(P>0.05),其他8种EAA动脉血浆浓度上升的幅度也不相同,这反映了消化道吸收EAA被消化道组织、肝脏的代谢程度和外周体组织的利用程度不同。在Guinard等、Clark等、Derrig等、Schwab等和Spires等的试验中,也观察到Val、Ile、Leu和Lys的动脉血浆浓度受消化道吸收量影响较大的结果。以酪蛋白灌注前后颈动脉血浆中浓度未发生明显改变的Arg为100和99g/(d·只)酪蛋白灌注组与未灌注酪蛋白的对照组比较,Thr、Phe、Met和His的比例变化不大,Val、Lys、Leu和Ile的比例增加了2倍左右。另外,本研究还发现,随着真胃酪蛋白灌注量的增加,动脉血浆尿素氮含量明显升高(P<0.05),Whitelaw等也观察到了相似的结果。有关动脉血浆中NEAA变化的研究结果报道不一致。在本试验中,除了Gly和Ala外,所有NEAA都不同程度地随酪蛋白灌注量的增加而增加。这一结果和Cant等、Seymour等和Whitelaw等的研究结果相似,但Spires等未观察到动脉血浆NEAA浓度因酪蛋白灌注而提高。动脉血浆中Pro含量明显升高可能和灌注的酪蛋白中Pro的含量较高有关。然而,动脉血浆中Tyr含量升高可能是在组织中苯丙氨酸氢化酶的作用下使Phe转化为Tyr的缘故。这种解释在本试验中灌注酪蛋白钠后动脉血浆中Phe的浓度明显提高所证实。相反,在本试验中随着酪蛋白钠灌注量的增加,动脉血浆中Gly的含量却明显下降,这和Guinard等、Rulquin和Whitelaw等的研究结果一致。血浆中Gly的含量反映了肌肉蛋白质的周转代谢,因为肌肉中的Gly含量很高。过瘤胃灌注酪蛋白,可能会减弱其整体蛋白质的代谢。因此,降低了肌肉中Gly的释放,结果导致动脉血浆中Gly含量的下降。4.4灌注结构和诱导氨基酸对乳蛋白合成的影响Guinard等研究表明,乳蛋白产量与乳腺组织EAA的吸收率同向变化,二者之间存在正相关关系。在本试验中,除Thr和Ala外,随着酪蛋白灌注量的增加,乳腺组织对所有氨基酸的吸收速度均有明显提高(P<0.05),与乳蛋白产量随酪蛋白灌注量的升高相对应,说明乳腺组织对氨基酸的吸收速度可能是乳蛋白合成的调控因素之一。除了Thr、Val、His、Lys、Ile和Pro外,随着酪蛋白钠灌注量的增加,乳腺组织对所有氨基酸的提取率均显著升高(P<0.05)。这一结果和Derrig等的研究结果基本一致。然而,在Clark等和Spires等的研究中发现,灌注酪蛋白并不影响乳腺组织对这些氨基酸的提取率。这种差异可能与试验动物的泌乳性能有关。乳腺组织氨基酸的提取率可能依赖于乳腺分泌细胞的生物合成的活性,而改善营养状况可能不会使乳腺乳蛋白的合成能力达到最大化。这一点还有待今后进一步的研究和验证。一些研究者将乳腺组织氨基酸的提取率作为评价氨基酸限制顺序的参考。按照这一评价原则,本研究中,就对照组而言,乳蛋白合成的限制性氨基酸顺序为Met(33.89%)、Lys(31.97%)和Phe(27.93%)。而真胃灌注酪蛋白后,则限制性氨基酸的顺序为Met(48.71%)、Phe(42.44%)和Lys(31.06%)。通过酪蛋白的灌注,乳蛋白合成的第一限制性氨基酸没有改变即Met,而和对照组相比,第二限制性氨基酸由Phe所替代,Lys则为乳蛋白合成的第三限制性氨基酸。这一结果和Fraser等的研究结果有所不同,可能是由试验动物基础日粮不同而引起,因为乳蛋白合成的限制性氨基酸受泌乳阶段和饲粮组成的影响。所测定的16种氨基酸中,动脉血浆中Arg、Thr、Lys、Leu和Phe等5种EAA和Asp、Ser、Gly、Ala和Tyr等5种NEAA的乳腺组织提取率组间差异显著(P<0.05),随酪蛋白钠灌注量的增加而提高的趋势,其他氨基酸的乳腺组织提取率的组间差异不显著(P>0.05),所有16种氨基酸的动脉血浆浓度均随酪蛋白灌注量的增加显著升高(P<0.05)或呈升高趋势。因此,较之乳腺组织提取率或动脉血浆浓度,乳腺组织氨基酸吸收速度或吸收量更敏感地反映了乳腺组织对氨基酸需要量的变化,而乳腺组织吸收率在评价氨基酸的限制顺序上可能更为有用。4.5u/d只u/s对乳腺癌中离子型自身吸收量的影响乳腺组织游离氨基酸吸收量/乳中分泌量反映了乳腺组织对吸收游离氨基酸用于乳蛋白合成的效率,同时也反映了吸收游离氨基酸是否是用于乳蛋白合成的主要氨基酸来源。本试验结果表明,除Ala外,其他NEAA的吸收量一般低于由乳蛋白分泌的数量,尤其是Asp和Gly。在本试验条件下的最大吸收量不超过乳蛋白分泌量的40%,说明从血液中吸收的游离氨基酸可能不是用于乳蛋白合成的氨基酸的主要来源,在乳腺中合成或吸收自血液的小肽可能是这些氨基酸的更重要来源。值得注意的是,Thr的吸收量也远低于乳蛋白中的分泌量,且其吸收量不受酪蛋白钠灌注的明显影响。作为EAA,Thr不可能在乳腺中大量合成,来自血液中的小肽吸收就成了乳蛋白合成所需Thr的唯一可能的其他来源,对此值得深入研究。其他测定的EAA大致可以分为3类,Arg、Lys、Val和Ile即使在日粮粗蛋白质供给量仅满足需要量70%的情况下(0g/(d·只)酪蛋白钠灌注组),其乳腺组织的吸收量也高于或接近从乳蛋白中分泌的数量,并且其U/S随着酪蛋白钠灌注量的提高而提高,说明这4种EAA有相当数量在乳腺组织中用于其他途径的代谢;Ile、Leu和Met在日粮蛋白质供给量不足时,其乳腺组织吸收量低于从乳蛋白分泌的数量,随着酪蛋白钠灌注量的增加,其U/S提高,乳腺组织吸收量高于乳蛋白分泌量,说明这3种EAA在供给量不足时主要用于乳蛋白的合成,而当供给充足时有可能在乳腺组织中用于其他途径的代谢;His的U/S组间差异不显著,且略高于1,说明其乳腺组织受到比较精确的控制,吸收的游离His主要用于乳蛋白的合成。在Davis等、Jois等、Mepham等和Guinard等的试验结果中,乳腺组织对Thr、His、Met和Phe的吸收量小于或大致等于乳蛋白合成的需要量,乳腺组织对这些EAA的乳蛋白合成利用效率较高,与本试验的结果相似。在Mepham等