第三章-细胞工程

第三章细胞工程植物细胞工程：植物组织培养；植物细胞培养；植物原生质体制备与融合；人工种子动物细胞工程：细胞/组织培养；细胞融合；单克隆抗体；细胞核移植、动物克隆；染色体转移；干细胞技术微生物细胞工程细胞培养定义：指将从机体取出的细胞在体外进行培养，使之继续生存或生长的方法，是目前生物学、医学生物学和药学研究领域普遍采用的基本技术美国时代杂志展望未来最热门的医药生物领域如下１、组织细胞工程２、基因治疗３、个体化治疗：总结：没有细胞培养，就没有未来的医学徐荣祥教授在完成了系统的用组织细胞在体外和体内原位克隆复制组织器官的研究后，于2001年向美国及世界发达国家申报了专利，现在美已陆续获得4项发明专利权细胞工程基本技术：(1)无菌操作技术：(2)细胞培养技术：

(3)细胞融合技术：

一、植物细胞工程基本术语：外植体：用于植物组织(细胞)培养的器官或组织的切段。（包括根、茎、叶、花、果、穗、胚珠、胚乳、花药、花粉等）愈伤组织：具全能性、可传代、未分化的细胞团。胚状体：具芽端和根端，类似合子胚的构造。1植物组织培养：A.培养基

碳源、氮源、无机物、维生素B.生长调节剂

生长素：吲哚乙酸(IAA)、α-萘乙酸(α-NAA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)细胞分裂

细胞分裂素：激动素、6-BA、玉米素等细胞生长。培养基的固化剂：琼脂：90%D-半乳糖与10%L-半乳糖的聚糖；海藻酸钠：L-葡糖醛酸高聚物的钠盐；

(1)预备合适的外植体(2)除菌(3)选用适宜的培养基(4)外植体去分化(5)继代增殖(6)形成胚状体(7)炼苗C.植物组织培养步骤

初级代谢物：核酸、核苷、核苷酸、氨基酸、蛋白质、糖类；次级代谢物：代谢产生的无明确的生理功能的与生命无关的成分。生物碱、黄酮、萜类、有机酸，etc.植物培养细胞的生长阶段：

延迟期：细胞分裂初始期至最大生长期；对数期：最大生长期，最佳DNA和蛋白质累积率；细胞数增加；稳定期：细胞重量增加；蛋白质合成停止；

衰退期：细胞高度分化；次级代谢物累积。2植物细胞培养【次生(级)代谢物生产】A.悬浮培养系统：细胞并不以单一细胞悬浮生长，而多以非均相集合体的细胞团形式存在(原因是：细胞分裂后未分离、粘多糖的分泌形成粘性表面)。(1)小规模悬浮培养：静止培养：振荡培养：(2)大规模培养系统：①成批培养法：

②半连续培养法：

③连续培养法

B.固定化细胞培养系统：

先通过悬浮培养获得足够细胞数，再将其包埋于惰性支持物内部或贴于表面，放入培养液中培养或连续流入新鲜培养液进行连续培养。优点：

有利于细胞的分化；便于细胞团间形成化学物质/物理因素梯度。(1)平床培养系统：(2)立柱培养系统：细胞融合目的：获得双亲本优良性状的杂种生物。

原生质体：细胞除去细胞壁后的剩余部分。

原生质球(球状体)：残存少量细胞壁的原生质体。3植物细胞原生质体制备与融合

a取材：选取生长活跃的组织/器官。

b除菌：

c酶解细胞壁：纤维素酶、果胶酶、蜗牛酶

d分离：过滤、低速离心、比重漂浮法。

e用新渗透压稳定剂或培养液洗涤。

f鉴定：形态观察：直接显微镜观察、荧光增白剂染色、台盼蓝活细胞染色、胞质环流观察；原生质体活力检测：光合作用、呼吸作用。(1)原生质体的制备

(2)原生质体的融合

a化学诱导直接融合：PEG结合高钙高pH诱导法：将双亲原生质体与30%PEG混匀，静置，滴加高钙高pH溶液，使均匀并静置，以培养液洗涤，离心得细胞团。方法特点：对细胞有一定毒性，因此融合时间的控制很重要；丙酸钙较氯化钙产生较高的融合率。

b物理诱导直接融合：微电极法

c不对称融合法：对一方原生质体适当处理后再与另一方融合。

天然种子：由胚珠受精发育而来。(1)种皮：源于珠被；(2)胚乳：极核受精发育而成，营养组织；(3)胚：胚根、胚茎、胚芽、子叶。人工种子：(1)人工种皮：海藻酸钠(2)人工胚乳：营养与生长调节因子.(3)胚状体：由外植体经培养形成。4人工种子研制胚状体的制备：①外植体经过培养，得多个胚状体(它们处于胚胎发育的不同时期)；②胚状体的同步生长：低温法抑制剂法分离法通气法渗透压法①制备同步发育的胚状体；②配制含4%海藻酸钠的人工胚乳液；③混匀胚状体和人工胚乳液；④滴入约2%的CaCl2溶液中，得粗品；⑤无菌水漂洗；⑥表面处理以抗粘。人工种子制备流程二、动物细胞工程1动物细胞培养动物细胞生长特点：贴壁生长。培养基：基础培养基（由氨基酸、维生素、糖类、无机盐、核酸前体等组成）

血清(激素、酶及pH缓冲)

无血清培养基：基础培养基(1)基质因子：结合蛋白、贴附和伸展因子等.(2)激素和生长因子。培养动物细胞可分为两类：

贴壁依赖型细胞：需要附着固体或半固体表面才能生长。大多数动物细胞，包括非淋巴组织细胞和许多异倍体细胞均属于这一类。

非贴壁依赖型细胞：无需附着于固相表面即可生长。包括血液、淋巴组织细胞、许多肿瘤细胞及某些转化细胞。

动物细胞培养过程：

一般为幼龄动物或胚胎，分裂次数多。要将组织分散成单个细胞，可怎样处理？此处细胞能无限生长和增殖吗？

一般为幼龄动物或胚胎，分裂次数多。可用胰蛋白酶处理使之分散成单个细胞。原代培养不能。需要定期转移、分装培养。

一般为幼龄动物或胚胎，分裂次数多。可用胰蛋白酶处理使之分散成单个细胞。原代培养原代培养

（primaryculture）：从动物机体取出的进行培养的细胞群。原代培养的细胞生长比较缓慢，而且繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长，需要从更换培养基。将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养（Passage）。原代培养

（primaryculture）：从动物机体取出的进行培养的细胞群。原代培养的细胞生长比较缓慢，而且繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长，需要从更换培养基。将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养（Passage）。

原代培养：从动物机体取出的进行培养的细胞群。

传代培养：原代培养的细胞生长比较缓慢，而且繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长，需要从更换培养基。细胞株（cellstrain）：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，能够繁殖50代左右，在培养过程中其特征始终保持。

细胞株：从原代培养细胞群中筛选出进行传代培养的细胞，能传到40-50代，其遗传物质没有发生变化。

细胞系：传到40-50代后有部分细胞遗传物质发生了变化，带有癌变的特点，可能在培养条件下无限制的传代下去，这种传代细胞称为细胞系。2动物细胞融合(1)病毒诱导法：双亲本细胞悬液混合离心使聚集均匀加入灭活仙台病毒悬液诱导冰浴令细胞凝集再37℃水浴令细胞融合移至选择培养基上选择培养克隆.融合率低、重复性差。病毒诱导法原理(2)化学诱导法：30%PEG(分子量<2000)，PEG液的pH宜为7.4～8.0。适当离心、加入适量二甲亚砜有利于融合。(3)电激融合单克隆抗体技术（１）基本概念抗原：