第六章 植物细胞制药

第六章植物细胞工程制药第一节概述人们利用植物作为药物已有几千年的历史了，尤其是我国对中草药的应用。高等植物的次生代谢产物丰富多样，应用范围广。植物代谢产物多为混合物，其比例很关键。植物是活性化合物的最丰富的来源。通过植物细胞的大量培养可以解决植物生长周期长、代谢成分复杂等问题，以获得大量活性物质。植物细胞培养生产天然药物并实现工业化生产的关键是提高单位培养基中目的物质的产量、降低生产成本，包括改进培养条件、筛选高产细胞株、研制适合于植物细胞大量培养的新型生物反应器。一、植物细胞工程技术及应用

植物细胞工程：是指以植物细胞为基本单位，应用细胞生物学、分子生物学等理论和技术，在离体条件下进行培养、增殖，使细胞的某些生物学特性按照人们的意愿发生改造，从而改良品种、制造新品种、加速繁育植物个体或获得有用物质的一门科学或技术。植物细胞工程主要由两部分构成：上游工程，包含细胞培养、细胞遗传操作和细胞保藏三个步骤。下游工程，将已转化的细胞应用到工业生产中，生产生物产品的过程。其中细胞培养是细胞工程的技术基础。1、植物细胞工程技术（1）快速繁殖技术

通过植物体细胞胚胎再生成一完整植株。这种技术主要用于花卉、树木、蔬菜、果树、中草药和农作物的快速繁殖。（2）诱导增加或减少植物体内染色体组数的技术

有些植株的染色体比正常细胞少一半（单倍体），而有些经诱导后染色体加倍（多倍体）。单倍体有利于植物品种的改良；多倍体产量高，为不同倍性植物间的杂交提供了遗传保证。（3）体细胞杂交技术

利用自然或人工方法使两个或几个不同细胞融合成一个细胞，形成体细胞杂种。（4）植物细胞生产应用技术

利用植物细胞培养技术，提供植物细胞最适宜的生活环境，进行无性繁殖，大量地培养成植株，解决天然资源的不足。2、植物细胞工程的应用（1）细胞育种诱导突变，筛选新品系、新品种。（2）次级代谢产物生成从培养的植物细胞中提取所需的代谢产物。优点：比栽培原料作物更易控制最佳生产条件；培养物为无菌材料，能保证产品质量；工艺操作较为简单，可减少成本，提高生产率。3、植物细胞工程生产的药物目前，已经从400多种植物中分离出细胞，通过细胞培养，获得600多种所需的化合物，其中有60多种在含量上超过或趋于原植物，包括色素、固醇、生物碱、维生素、激素、多糖、植物杀虫剂及生长素等数十类。已有紫杉醇、紫草素、迷迭香酸和人参皂苷等产品进入工业化生产阶段。二、植物细胞工程发展简史

19世纪上半叶，提出了细胞学说。20世纪初叶，德国著名植物学家依据细胞理论，首次提出了高等植物的器官和组织可以不断分割，直至单个细胞。20世纪20年代初至30年代，胚胎培养和器官培养取得了一些成果。

30年代末至40年代，研究工作主要集中在植物细胞器官与营养需求之间的关系。40年代末至50年代，植物组织培养取得新进展，确定了腺嘌呤和生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。

60年代初，分离出植物的原生质体。

60至70年代中叶，主要工作是开发培养基和研究培养方法。

1975-1985年主要进行优化细胞生长和次级代谢产物形成的研究。最近10年应用分子生物学，取得红豆杉细胞培养生产抗癌新药紫杉醇成果。现在已经具备在２万升规模的生物反应器中培养烟草细胞的能力。日本的三井石化使用750L发酵罐通过培养植物细胞生产紫草宁，产量较高，可满足全日本百分之四十以上的需要。三、相关概念1、植物组织培养在无菌条件下，对离体植物组织（器官或细胞）分离并在培养基中培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技术。目前已发展出愈伤组织培养、悬浮培养、器官培养、胚胎培养等类型的植物组织培养。2、植物细胞的全能性即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组，故具有发育成完整植株的潜在能力。

组织培养的理论依据是植物细胞的全能性。植物组织体内原本已经分化的细胞，一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出全能性，从已经分化定型的细胞，脱分化，成为恢复分裂能力的细胞，并能重新生长发育成完整的植株。3、愈伤组织

愈伤组织是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成无序结构的一团细胞。4、悬浮培养在愈伤组织培养技术基础上发展起来的一种培养技术。以能够保持较好分散性的离体细胞或较小细胞团在液体培养基中进行培养。5、细胞培养

利用单个细胞进行液体或固体培养，诱导其增殖及分化。目的是为了得到单细胞无性繁殖系。6、分生组织培养

又称生长锥培养，在人工培养基上培养茎端分生组织细胞。

7、器官培养指植物根、茎尖、叶、花器官各部分原基或未成熟的花器官各部分以及未成熟小果实的无菌培养。8、胚胎培养对植物的胚(种胚)及胚器官(如子房,胚珠)进行人工离体无菌培养，使其发育成幼苗的技术。

9、外植体从植物体上分离下来的用于离体培养的材料（器官或组织）。植物的个部位如根、茎、叶、花、果、穗、胚珠、胚乳、花药和花粉等均可作为外植体进行组织培养。

10、器官形成一般指在组织培养或悬浮培养物中芽、根或花等器官的分化与形成。11、无性繁殖

又叫克隆，指使用母体培养物反复进行继代培养时，通过同种外植体而获得越来越多的无性繁殖后代。

12、突变体

细胞本身发生遗传变异或应用诱变处理发生的遗传变异所得的新细胞。

13、继代培养

由最初的外植体上切下的新增殖的组织，培养一代称为“第一代培养”，连续多代的培养就称为继代培养。14、次级代谢作用和次级代谢产物

除了核酸、核苷、核苷酸、氨基酸、蛋白质及糖类以外，具有如下特征的成分为次级代谢产物：有明显的分类学区域界限；其合成需在一定的条件下才能发生；缺乏明确的生理功能；是生命的多余成分。

次级代谢作用是特殊蛋白质内源化合物的合成、代谢及分解作用的综合体现。生物碱、黄酮体、萜类、有机酸、木质素等。第二节植物细胞的形态及生理特性一、植物细胞的形态单细胞植物，藻类；多细胞植物其细胞形态多种多样，球形、类圆形、椭圆形、角形；具有支持作用的细胞的细胞壁常增厚，类圆形、纺锤形；具有输导作用的细胞呈管形。

细胞大小不一，基本组织细胞体积较大，直径在20-100微米之间；储藏组织细胞的直径可达1毫米；最长的细胞是无节乳管，长达数米至数十米。二、植物细胞的结构特征高等植物为真核生物，在光学显微镜下，细胞壁、细胞核和液泡以及细胞内一些较大的结构容易辨认。植物细胞由细胞壁和原生质体组成，原生质体包括细胞质、细胞核和液泡。与动物细胞相比植物细胞有三个特点，即具有细胞壁、液泡和质体（叶绿体）。三、细胞后含物和生理活性物质

细胞中除含有生命物质原生质体外，还有许多非生命物质（亦称后含物）。细胞的代谢产物，一类是后含物，是储藏物质或废弃物质，分布于液泡内，如糖类、盐类、生物碱、糖苷类、有机酸、挥发油等；另一类是生理活性物质，对细胞内生化代谢和生理活动起着调节作用，如酶、维生素、植物激素、植物杀菌素等。1、细胞后含物（1）生物碱：含氮有机化合物，中药含有多种生物碱，如麻黄碱、咖啡因、阿托品、奎宁、黄连素等。（2）糖苷类：某些有机化合物和糖经糖苷键结合而成，对疾病有很好的治疗作用。（3）挥发油：具有芳香气味，如薄荷油、丁香油和桉油等。（4）有机酸：糖类代谢的中间产物，如苹果酸、柠檬酸、水杨酸、酒石酸等。2、生理活性物质

对细胞内生化反应和生理活动起调节作用。

（1）酶类：生物催化剂；

（2）维生素：参与酶的形成，对植物生长、呼吸、物质代谢有调节作用；

（3）植物激素：调节代谢；

（4）抗生素和植物杀菌素：杀死和抑制某些微生物生长的物质。四、植物培养细胞的生理特性植物培养细胞不同生长阶段的持续时间及特征（表）生长阶段持续时间特征延迟期分裂的初始期取决于培养前的细胞数恒定，RNA含量高，和最大生长期条件、时间和培蛋白质合成强，有丝分裂之间养基性质加速，细胞的细胞质部分增加。加速期细胞最大生长期3-4代细胞数、DNA、蛋白质浓度和最大细胞浓度增加，有丝分裂活性、RNA最佳DNA和蛋白质含量和蛋白质合成能力降累积率。

低。对数期介于最大生长率蛋白质合成能力完全减退和蛋白质合成完多聚核糖体解离。全停止期之间

稳定期细胞数稳定细胞高液泡化、极度脆弱、有机化合物浓度高（1）植物细胞重量的增加主要在对数期，而次级代谢产物的累积主要在稳定期。（2）植物细胞多以非均相集合体的细胞团形式存在，细胞团产生的原因有：①细胞分裂之后没有进行细胞分离；②在间歇培养过程中，细胞处于对数生长后期时，开始分泌粘多糖和蛋白质，或以其他方式形成粘性表面，从而形成细胞团。（3）细胞外骨架相当脆弱，表现为抗张力强度大，抗剪切力能力小，要采用合适的搅拌。（4）所有植物细胞都是好气性的，培养需通气，但不需要很高的气液传质速率，而是要控制供氧量，以保持较低的溶氧水平。（5）泡沫性质不同于微生物发酵，气泡大，黏度也大，通常要采用化学或机械方法加以控制。（6）培养过程中可能会黏附于反应器壁、电极或挡板的表面上。第三节植物细胞培养的基本技术植物细胞培养生产药物的基本过程：材料准备（外植体的选择、培养条件选择）

诱导分化愈伤组织继代培养（优良细胞系筛选、建立）

规模化生产培养

产品提取、分离纯化一、材料的准备

1、外植体的选择与高产细胞株的建立适宜于工业化生产的细胞株，应达到下列基本条件：分散性好，适于工业化生产；细胞形态均一性好，甚至在生理生化状态上同步；生长迅速；细胞中次生产物含量高；细胞生长和次生产物合成能力稳定。（1）外植体的选择选择次生代谢产物含量较高的原植物为外植体；天然产物一般为次级代谢产物，在起始细胞培养时，应尽量选择自然状态下产生天然产物的器官、组织为外植体。同时，考虑同一植物不同部位外植体的分化能力、分化条件及分化类型。（2）高产细胞株的建立以愈伤组织作为规模细胞培养的细胞来源，在外植体选定后，首先要诱导愈伤组织，在外植体诱导出愈伤组织后，筛选生长快、次级代谢产物合成能力强的细胞系。筛选高产细胞系的方法：直接筛选法和诱变筛选法。高产细胞系建立的方法：①广泛采集属内或科内不同种、不同年龄、不同地区、不同器官的高含量亲本株的外植体诱导新的愈伤组织，建立新的无性细胞系；②建立直板法及细胞团块法从细胞系中快速分离筛选高产细胞株；③采用特定培养基进行定向富集筛选，获得激素自养型及耐受高剂量细胞毒化剂的驯化系；④对细胞继代稳定性进行研究，建立有利于高产细胞株种质稳定的继代培养方法。（3）外植体处理用于植物组织培养的外植体，必须无菌材料。外植体如果含有其他微生物，要进行严格的灭菌，以免在培养基中微生物大量迅速繁殖而影响植物组织的培养。常用表面灭菌试剂，其特点是灭菌后易于除去或容易分解。根据所处理材料对灭菌试剂的敏感性选择适当的处理时间。常用灭菌试剂有次氯酸钙、次氯酸钠和氯化汞。次氯酸钙为工业漂白粉过滤后的饱和溶液，适用于草本植物和柔软组织的灭菌处理，时间为5-30min。氯化汞灭菌效果好，但不易除去，时间不易过长，以免杀死植物细胞。其用于休眠种子的灭菌剂最为理想，适用浓度为0.1%，2-10min，种子皮较厚时可延长至20min以上。

2、培养基及其组成

培养基是植物离体器官、组织或细胞等的无菌土壤，营养成分可调控。

植物细胞或组织培养基常含有无机盐、碳源、有机氮源、植物生长激素、维生素等成分。应用最广泛的培养基是MS培养基和LS培养基。MS培养基1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的，无机盐和离子浓度较高，为较稳定的离子平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物细胞的营养和生理需要。硝酸盐(钾、铵)的含量较其他培养基为高，广泛地用于植物的器官、细胞和原生质体培养，效果良好。B5培养基1968年由Gamborg等为培养大豆根细胞而设计的。其主要特点是含有较低的铵，从实践中得知，有些植物在B5培养基生长更适宜：如双子叶植物特别是禾本植物。white培养基1934年white为培养番茄根尖而设计的，1963年又作了改良。本培养基的特点是无机盐数量较低，适于生根培养。KM-8P培养基1974年为原生质体培养而设计的。其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素、呼吸代谢中的主要有机酸。广泛应用于原生质体和融合体的培养。LS培养基与MS基本成分较为接近，LS培养基去掉了甘氨酸、盐酸吡哆醇和烟酸。

（1）无机盐

基本培养基是由各种浓度的无机盐溶液组成。无机盐又分为大量元素和微量元素。大量元素是指使用浓度大于30mg/L的无机元素，有氮、硫、磷、钾、镁、钙、氯、钠。微量元素是指使用浓度低于30mg/L的无机元素，如铁、锰、碘、钼、铜、锌等。磷的消耗很快，但机体自身可产生磷可满足需要；氮常以铵盐或硝酸盐形式提供。钾、镁、钙离子对细胞代谢必不可少，镁离子参与多种辅酶和激活子的合成；钾离子、钙离子可抑制某些酶的活性，有时钙离子也可保持某些酶的活性或稳定性。微量元素的作用是参与辅因子的形成，并可诱导酶的合成。

（2）碳源

植物细胞培养物通常为异养细胞，常用的碳源为碳水化合物、肌醇、甘油、乳糖和半乳糖等。天然提取物（如椰子乳）对愈伤组织的诱导和培养也有重要意义。（3）植物生长调节剂植物激素是植物代谢过程中形成的生长调节物质，在极低浓度（小于1µmol/L）时，即能调节植物的生长、发育过程，并能从合成部位转运到作用部位而发挥作用。常见的5种植物激素：生长素、分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯。愈伤组织或培养细胞的生长和生存依赖于合成的生长素或天然生长素，生长素可诱导特异酶类。植物组织和细胞培养物的生长过程主要取决于生长素和分裂素的比例，比值高可刺激细胞分裂；比值低则刺激细胞生长。对于植物培养细胞，绝大多数培养基中都必须加入一定量的植物生长调节剂。

（4）有机氮源

常用蛋白质水解物或各种氨基酸。有机氮源对细胞的早期生长有利，氨基酸的加入是为了代替或增加氮源的供应。

（5）维生素

植物细胞通常是维生素自养型，但大多数情况下，其合成的量不能满足需要，需加入B族维生素，以及生物素和肌醇。

二、培养方法按培养对象：原生质体培养和单倍体细胞培养；按培养基类型：固体培养和液体培养；按培养方式：悬浮培养和固定化细胞培养。固体培养包括琼脂培养和固定化培养。优点：简便易行、所占空间小。缺点：①外植体或愈伤组织仅有一部分与培养基接触，培养基中产生浓度差，愈伤组织生长不平衡；②外植体基部插入培养基中，该处气体交换不畅，阻碍了组织呼吸正常进行，会堆积生长过程中的有害物质；③在愈伤组织细胞间出现极化现象，导致细胞群体不均一；④固体培养物有时要测定一些生理生化指标，还需转入液体。植物细胞的培养温度为25℃左右，常需光照，光照以每天16h为宜，一般用日光灯照射。由于植物组织在培养基上生长时要不断消耗养分、散失水分和累积代谢产物，因此外植体在培养3周左右必须移至新鲜培养基上，以保持继续生长。移换一次培养基成为一次继代培养，经过一定次数的继代培养，其培养物可用于悬浮培养。液体培养系统包括小规模的悬浮培养和大规模的成批培养、半连续和连续培养。悬浮培养有静止培养和振荡培养两类。1、成批培养法

将培养基一次性加入反应器中，接种、培养一定时间后收获细胞的操作方式。最适于植物细胞培养的是气升式反应器。根据次级代谢产物的大量积累一般发生在细胞生长的稳定期，植物细胞采用两步培养法，使用两个反应器：第一个用于细胞生物量的累积，第二个用于次级代谢产物的生产。2、半连续培养法

在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养基进行交换的培养方法。

3、连续培养法

利用连续培养反应器，在投料和接种一段时间后，以一定的速度连续采集细胞和培养液，并以同样速度供给新鲜培养基以使细胞生长环境维持恒定的方法。4、固定化培养法

固定化反应器有网状多孔板、尼龙网套和中空纤维膜等多种类型。将细胞固定在尼龙网套内或固定于中空纤维膜反应器的膜表面，或固定于网状多孔板上，放入培养液中进行培养，或连续通入新鲜培养基，进行连续培养及连续收集细胞；也可通入净化空气代替搅拌。固定化的优点是细胞位置固定，易于获得高密度细胞群体和维持细胞间的物理化学梯度，利于细胞组织化，易于控制培养条件及获得次级代谢产物。三、影响植物次级代谢产物累积的因素影响次级代谢产物产生和累积的因素主要有：①生物条件：外植体、季节、休眠、分化等；②物理条件：温度、光（光照时间、光强、光质）、通气（氧气）、pH和渗透压；③化学条件：无机盐、碳源、植物生长调节剂、维生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物质和前体等；④工业培养条件：培养罐类型、通气、搅拌和培养方式等。1、外植体的选择

不同外植体的悬浮培养物，其最大次级代谢产物的积累时间不同。同一化合物可以在不同外植体的不同生长阶段累积。

2、培养条件的影响

培养环境的内在因素：营养成分、生物及非生物元素、pH、通气以混合程度、与接种有关的因素。外部因素：剪切力、搅拌频率、温度和光等。（1）培养环境的内在因素

①接种和诱导

外植体的大小直接影响所诱导的组织和细胞的生长，而且也关系到其次级代谢产物的生产能力。外植体的前处理也可严重影响次级代谢产物的累积方式。②培养基的组成基本培养基的各种成分是愈伤组织和悬浮细胞培养的物质基础。磷：低磷会导致次级代谢产物的累积，缺乏磷会导致生物量的大幅度降低。氮：有些植物可利用硝酸盐作为第一氮源；有些则利用铵盐作为第一氮源；有些需要两种氮源；有的需要特殊的有机氮源。如天冬氨酸