第03章 基因工程载体精简版

第三章基因工程载体概述质粒载体噬菌体载体和粘粒载体人工染色体概述什么是载体所谓载体是指能够携带外源DNA片段进入受体细胞并具有自我复制功能的核酸分子。载体具备的基本条件在宿主细胞内独立自我复制具有合适的限制酶切位点具有合适的选择标记基因载体的功能

1.运送外源基因高效转入受体细胞

2.为外源基因提供复制能力或整合能力

3.为外源基因的扩增或表达提供条件第一节质粒载体什么是质粒质粒的生物学特性质粒的分离与纯化质粒载体的构建及类型质粒载体的稳定性什么是质粒(plasmid)质粒是染色体外的能自我复制的环状核酸分子。不能独立的存在，只能随寄主细胞分裂而遗传，能独立进行复制，广泛的存在于原核生物或一些真核生物中质粒的生物学特性质粒的一般性质质粒编码遗传表型质粒的结合转移特性质粒的不亲和性质粒的复制特性质粒的一般分子特性细胞质粒大多是环形DNA分子质粒可以稳定的存在于染色体外，在一定条件下也会整合到染色体上质粒一般有三种构型：共价闭合环形DNA；开环DNA；线形DNA自主复制型载体和附加载体的扩增方式LinerDNAOpencircleDNASupercircleDNA质粒编码遗传表型由于质粒的存在赋予寄主细胞许多额外的表型如:抗药性特征、代谢特征、修饰寄主生活方式的特征等在基因克隆过程中应用较多的有抗药性特征、促进质粒转移的特征、产生大肠杆菌素的特征等，这些特征在重组子的筛选和表达载体的构建过程中得到充分的应用质粒的复制类型严紧型(stringentplasmid)质粒复制受宿主染色体DNA严格控制，拷贝数少，1-3个松弛型（relaxedplasmid)受宿主控制比较松拷贝数多，10-200个质粒的不亲和性（不相容性）不亲和性（plasmidincompatibility):在没有选择压力的情况下，两种不同的质粒不能在同一个宿主细胞系中稳定共存的现象。在细胞的增殖过程中一种质粒逐渐被排斥、稀释掉，这样的两种质粒称为不亲和质粒。前提条件:A和B质粒B质粒进入含A质粒的寄主细胞B质粒DNA并不受寄主细胞的限制体系所降解A和B质粒不能长期共存不亲合群彼此不相容的质粒属于同一个不亲合群彼此相容的质粒属于不同的不亲合群质粒的不亲和性机理质粒的转移特性什么是质粒的转移？是指接合型质粒具有自主从一个细胞转移到另外一个细胞的特性接合型与非接合型质粒接合型：携带控制细菌配对和质粒结合转移的基因，能我转移。非接合型：不能自我转移关于F质粒控制质粒结合转移的因子主要是F因子，F因子称为F质粒。

F因子又叫致育因子，是雄性决定因子。是单拷贝接合型质粒，94kbF+：含F因子

的细胞，是雄性细胞

F―：不含F因子的细胞，是雌性细胞F质粒转移机制F+F―

混合培养F+表面的性须结构作用

雌、雄细胞配对F因子进入F―细胞通过性须结构F―细胞变成F+细胞F质粒转移机制非接合型质粒不能自我转移只携带自主复制所必需的遗传信息不具有细菌配对和质粒接合转移的基因分子量小属于松弛型质粒载体的构建理想的质粒载体分子量小，拷贝数高。有多克隆位点（mcs)有两种以上的选择标记基因缺失mob基因和tra基因重组质粒易导入宿主细胞多克隆位点（mcs):multiplecloningsite是载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制性核酸内切酶位点的DNA片断。

HindIIISphISse83871PstIHincIIAccISalIXbaIBamHISmaIXmaIKpnISacIEcoRI

pYES2质粒载体的多克隆位点

质粒载体的构建载体必须具备复制必需区选择标记基因克隆位点载体的类型

克隆质粒载体表达质粒载体多功能质粒载体穿梭质粒载体克隆质粒载体pBR322pBR322表达质粒载体pGEM3Z载体的结构及外源DNA的转录胞内表达载体分泌型表达载体原核细胞表达载体真核细胞表达载体大肠杆菌表达载体具备:强启动子核糖体结合位点序列强转录终止序列信号肽编码序列表达载体与克隆载体之区别植物表达载体多功能载体具有体外转录、克隆、基因表达、测序等功能穿梭载体(shuttleplasmidvector)具有两种不同复制起点和筛选标记，可在两种不同的宿主中存活复制的质粒载体

穿梭质粒类型大肠杆菌—土壤农杆菌大肠杆菌—酿酒酵母大肠杆菌—枯草芽孢杆菌大肠杆菌—动物细胞

第二节噬菌体载体与粘粒载体λ噬菌体载体粘粒载体一、λ噬菌体载体λ噬菌体作为克隆载体的优越性λ噬菌体的分子生物学概述λ噬菌体载体的构建λ噬菌体载体的类型λ噬菌体的体外包装λ噬菌体作为克隆载体的优越性克隆容量大：噬菌体载体与质粒载体相比具有更强的容纳外源DNA的片段的能力。噬菌体载体最大可以克窿23Kb外源DNA感染率高：每个噬菌体颗粒的感染率几乎是100%，而质粒DNA分子大约仅有0.1%的转化率噬菌体基因组可以整合到寄主染色体上与寄主染色体一起复制安全：噬菌体较质粒的宿主范围要窄的多，因而也就更加安全λ噬菌体的

生物学特性λ噬菌体的生活周期溶菌周期溶源周期烈性噬菌体温和噬菌体溶菌周期（裂解周期）溶源周期λ噬菌体的分子生物学概述基因组的结构λ噬菌体线形的DNA分子的长度是48502bp在λ噬菌体DNA分子的两端，各有一条由12个核苷酸组成的彼此完全互补的5′单链末端,噬菌体进入菌体细胞后，粘末端配对形成双连环状DNA,这个由粘末端结合形成的双链区段称为--COS位点。λ噬菌体基因组上的基因是按功能聚集在一起的,有四个功能区分别控制头部、尾部组装，以及复制和重组四个功能区Cos位点λ噬菌体的基因组分区λ噬菌体DNA的复制噬菌体感染的早期，环形的DNA分子按θ形式从双向进行复制感染的晚期，按滚环式复制合成出由一系列线性排列的基因组DNA组成的长多连体分子

λ噬菌体载体的构建消除多余的限制性酶切位点切掉非必要区段，减小分子量构建选择标记cI标记法LacZ基因功能选择法Spi-正向选择法引入无义突变λ噬菌体载体的