蛋白质化学中的层析技术

第四章

蛋白质化学中的层析技术

层析法也称色谱法(chromatography)，是1906年俄国植物学家MichaelTswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”。

1941年，英国生物学家Martin和Synge首先提出了色谱塔板理论，为后来各种色谱技术的发展奠定了基础。第一节层析概述第二节离子交换层析第三节亲和层析第四节凝胶过滤第五节疏水层析第六节分配层析第七节吸附层析第一节层析概述

一、层析的原理

层析技术是一组相关分离方法的总称，当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随流动相向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配，从而达到将各组份分离的目的。

二、层析的分类

按固定相基质的形式：柱层析、纸层析和薄层层析

根据流动相的形式：液相层析、气相层析

凝胶过滤原理吸附层析疏水层析分配层析亲和层析离子交换三、层析前蛋白质处理

主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。1、盐析法盐离子与水分子作用，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的水化层，暴露出来的蛋白质表面疏水性区域相互结合，形成沉淀。

2、等电点沉淀

在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入盐离子会破坏这些吸引力，使分子散开，溶入水中。3、有机溶剂沉淀降低水溶液的介电常数，增加蛋白质不同电荷之间的静电引力，使蛋白质产生沉淀；有机溶剂与水作用使蛋白质的表面水化层厚度压缩，导致蛋白质脱水，蛋白质间的疏水作用增强，从而产生沉淀。四、层析基本操作过程

装置选择上样和洗脱结果检测

上样均一性洗脱装置目的不同检测方法不同活性检测基质均匀性柱层析的L/d比值1、柱层析的L/d比值

2、洗脱装置

不改变溶剂体系依靠液面的水位差产生的静压力致使洗脱液不断流经层析柱缺点：随着溶液的流去，水位差也逐渐减小，流速也在变小。改善：蠕动泵或恒流泵维持流速恒定的简易装置

改变溶剂系统

分级洗脱在一个溶剂系统洗涤后，改用另一溶剂系统。缺点：蛋白质和层析基质的结合强度相差并不很大，溶剂系统的改变又不可能过细过密同一个洗脱级分中就可能含有两种或两种以上的蛋白质，达不到分离纯化的目的。递减递增pH阴离子交换树脂阳离子交换树脂离子强度疏水层析离子交换层析

改变溶剂系统

梯度洗脱

一种溶液以恒定的速度连续地进入处于温和搅拌的盛有另一种溶液的容器中，经混合后的液体以同速度沉入层析柱作为洗脱液，在这样所得到的洗脱液中一种溶液的浓度以线性梯度方式连续地发生改变。注意：梯度洗脱呈现一个峰，但有可能存在两个性质接近的蛋白质。线性梯度洗脱装置性能未知样品的蛋白质分离：改变缓慢的梯度洗脱→若为单峰：分级洗脱3、结果检测活性检测

比活没有提高

目的蛋白与杂蛋白并没有分开

比活有所提高，但总活性回收很低

目的蛋白有损失或有失活现象测定蛋白质一级结构时，可不考虑目的蛋白的生物活性结果保存薄层层析&纸层析照相保存or扫描仪转为图形or积分仪变成数据柱层析检测器、记录仪和积分仪处理4、层析装置的仪器化HPLC与微机、质谱等连用第二节离子交换层析

一、原理

离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。

原理：利用物质的电荷和层析载体的电荷间的相互作用，进而达到分离纯化的目的。

高分子聚合物基质、配基和平衡离子↙共价结合平衡离子平衡离子是结合于配基上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。阳离子交换剂：平衡离子带正电的离子交换剂，能与带正电的离子基团发生交换作用阴离子交换剂：平衡离子带负电的离子交换剂，与带负电的离子基团发生交换作用

pH值的影响

NH3RCOOH+NH3RCOO+-RNH2COO-LowpHPositivechargeHighpHNegativechargeHydrogengainedHydrogenlost离子溶度影响

→离子浓度增加

+离子取代顺序离子交换剂的基质

琼脂糖离子交换剂

离子交换交联葡聚糖聚苯乙烯离子交换纤维素

1、离子交换纤维素交换剂名

称（纤维素）作用基团特

点阴离子交换剂二乙氨基乙基DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2H最常用在pH8.6以下三乙氨基乙基DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2H氨乙基AE+-O-C2H4-NH2胍乙基强碱性、极高pH仍有效阳离子交换剂羧甲基CM—-O-CH2-COO—最常用在pH4以上磷酸P－-O-PO2－用于低pH磺甲基SM－-O-CH2-SO3－磺乙基SE－-O-C2H4-SO3－强酸性用于极低pH

常用：DEAE-纤维素（二乙基氨基纤维素）CM-纤维素（羧甲基纤维素）开放性长链和松散的网状结构，有较大的表面积，大分子可自由通过，使它的实际交换容量要比离子交换树脂大的多。亲水性，对蛋白质等生物大分子物质吸附的不太牢，用较温和的洗脱条件就可达到分离的目的，因此不致引起生物大分子物质的变性和失活。

回收率高优点：

2、交联葡聚糖类

型性

能离子基因反离子总交换容量（毫克当量/g）DEAE-sephadexA-25弱碱性、阴离子交换剂DEAE+Cl—3.5±0.5DEAE-sephadexA-50QAE-sephadex-25弱碱性、阴离子交换剂QAE+Cl—3.0±0.4QAE-sephadexA-50CM-A-sephadex25弱碱性、阳离子交换剂CM—Na+4.5±0.5CM-sephadexA-50SP-sephadexA-25强碱性、阳离子交换剂SP—Na+2.3±0.3SP-sephadexA-50

优点：不会引起被分离物质的变性或失活非特异性吸附少交换容量大

离子交换葡聚糖的选用：

一般根据蛋白质的分子量而定中等分子量（30000-200000）一般选A50和C50低分子量（＜30000）和高分子量（＞200000）均宜选用A25和C25。3、琼脂糖离子交换剂

交换剂名

称特点阴离子交换剂DEE-SepharouseCL-6B弱碱性pH:2-14DEAE-SepharouseFastFLowQ-SepharouseFF阳离子交换剂CM-SepharouseCL-6B弱酸性pH:2-14优点：对pH及温度的变化均较稳定，可在pH3～10和0～70℃范围内使用改变离子强度或pH时，床体积变化不大流速快，分辨率高特别适用于相对分子质量大的蛋白质和核酸等化合物的分离。

4、聚苯乙烯阴离子交换剂

AmberliteIRA&Dowexl

eg.Dowexl×4-100阳离子交换剂

AmberliteIRC&Dowex50强阴离子交换剂交联度为4%颗粒度为50-100目5、其他聚乙烯醇

DEAE-Toyopearl&CM-Toyopearl

富羟基

高亲水性兼性离子交换剂基质上连有β-丙氨酸、对氨基苯磺酸、精氨酸等偶极离子

or凝胶网孔中包含阴、阳离子的磷脂的脂质体

三、离子交换介质的配基提供了可交换的离子，是由带电荷的官能团组成通过或长或短的碳氢链经醚键结合到聚合物骨架上，相应的分别得到了阳离子和阴离子交换剂

配基结构pK分类简称硫酸基(sulphate)-OSO3H<2强酸S磺酸基(sulphonate)-(CH2)nSO3H<2强酸SM(n=1)，SE(n=2)，SP(n=3)，SB(n=4)磷酸基(phosphate)-OPO3H2<2和6中等酸性P羧酸基(carboxylate)-(CH2)nCOOH3.5-4.2弱酸CM(n=1)叔胺基(tertiaryamine)2(CH2)nN+H(C2H5)28.15-9.15弱碱DEAE(n=2)季胺基(quaternaryamine)2(CH2)n-2N+≡(R)3>9强碱Q，QAE

pK值决定了相应的离子交换剂的pH工作范围密度在配基密度达到一个极限值之前，蛋白质的吸附容量和保留值随着配基密度的增加而明显增加；过了极限值，蛋白质的吸附容量和保留值随配基密度的增加基本上没有影响。种类一般对同类型的离子交换剂来说，强阳(阴)离子交换剂比弱阳(阴)离子交换剂对蛋白质的结合能力强，需较强的盐浓度进行洗脱，相对的选择性较高

四、基本操作

缓冲液的选择层析柱的选择

洗脱流速↓↙加样洗脱洗脱液的监测收集及组分鉴定离子交换剂的清洗、再生和保存

↓↓↓←离子交换剂的处理

↘↑离子交换剂的选择

1、离子交换剂的选择配基的选择取决于被分离的物质在其稳定的pH下所带的电荷，如果带正电，则选择阳离子交换剂；如带负电，则选择阴离子交换剂。一般分离蛋白质等大分子物质常用弱酸型或弱碱型离子交换剂。

基质的选择价格分辨率和稳定性特点纤维素离子交换剂较低较低适于初步分离和大量制备葡聚糖离子交换剂适中适中受外界影响较大，体积可能随离子强度和pH变化有较大改变，影响分辨率琼脂糖离子交换剂较贵较高

颗粒大小

分辨率平衡时间流速应用小颗粒高长慢分辨率要求不高的大规模制备性分离大颗粒低短快需要高分辨率的分析或分离2、离子交换剂的处理酸碱浸泡进一步去除杂质，并使离子交换剂带上需要的平衡离子，一般阳离子交换剂最后用碱NaOH处理，阴离子交换剂最后用酸HCl处理。

膨化将干粉在水中充分溶胀，以使离子交换剂颗粒的孔隙增大，具有交换活性的配基充分暴露出来。水悬浮去除杂质和细小颗粒3、缓冲液的选择保证各个待分离物质的稳定；使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合，而尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定；注意平衡缓冲液中不能有与离子交换剂结合力强的离子，否则会大大降低交换容量，影响分离效果。离子强度和pH4、层析柱的选择亲和力相差不多而需要交换剂的体积较大增加柱长为宜，使待分离的组分被洗脱后再结合于交换剂上的概率增加，柱的直径与高度的比以1：20左右为宜。采用离子强度较大的梯度洗脱选用粗而短的柱子为宜。因为当柱上洗脱液的离子强度高到足以完全取代被吸附的离子时，这些被置换的离子则以同洗脱液等速率从柱上向下移动，如果柱细长，即从脱附到流出之间的距离长，使脱附的离子扩散的机会增加，结果造成分离峰过宽，降低分辨率。用交联葡聚糖离子交换剂和纤维素离子交换剂时，常用的柱高为15～20cm。5、上样样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。上样量要适当，不要超过柱的负荷能力，通常上样量为交换剂交换总量的1％-5％。

第八次课6、洗脱改变溶液的pH或改变离子强度当使用阴离子交换剂时，增加盐离子浓度，则降低pH值。当使用阳离子交换剂时，增加盐离子浓度，则升高pH值

亲和洗脱目的蛋白与加入离子发生特异性相互作用而被置换添加置换剂能置换基质上所有蛋白质洗脱方法阶段洗脱和梯度洗脱

7、洗脱速度洗脱速度通常要保持恒定洗脱速度慢比快的分辨率好如果洗脱峰相对集中某个区域造成重叠，则应适当缩小梯度范围或降低洗脱速度来提高分辨率；如果分辨率较好，但洗脱峰过宽，则可适当提高洗脱速度。8、洗脱液的监测收集及组分鉴定监测

用紫外检测仪进行，在280nm处观察洗脱液的光吸收收集

用分布收集器收集，可以自动收集，也可以手动收集鉴定

聚丙烯酰胺凝胶电泳、测定活性等9、离子交换剂的清洗、再生和保存

可溶于碱的污染物

0.1mol/LNaOH洗涤Milli-Q纯化的蒸馏水洗涤

结合缓冲液洗涤可以除去诸如脂类、蛋白质和核酸这类的污染物。对于疏水性污染物乙醇溶液（如70%的乙醇）或非离子型的去污剂洗涤可以除去脂类和其他的疏水性物质。→→金属污染物

EDTA饱和的10mmol/LHCL（即pH=2）处理柱子沉淀物杂质

去污剂、尿素和盐酸胍，可将柱子在6mol/L

的尿素中平衡和温育，然后用去离子水和缓冲液洗涤。

再生

对使用过的离子交换剂进行处理，使其恢复原来性状的过程。酸碱交替浸泡保存处理洗净蛋白等杂质后，加入适当的防腐剂，一般加入0.02%的叠氮钠，4°C下保存。五、应用实例阴离子交换层析

从人血浆中分离得到血清白蛋白(HSA)和免疫球蛋白G(IgG)

25mmol／L的乙酸钠缓冲液充分透析血浆

用乙酸将血浆的pH调至5.2，除去沉淀

上阴离子交换柱

pH5.2的乙酸缓冲液洗脱等电点较高的IgG

pH为4.5的同样浓度的同一缓冲液，以阶段洗脱的方式得到HSA

降低pH至4.0，同时升高缓冲液的浓度至150mmol/L，洗脱得到其他的糖蛋白↓↓↓↓↓

用DEAE-SepharoseCL-6B柱大量分级人血浆蛋白

阳离子交换层析用CM纤维素分离鸡蛋清中的蛋白质组份

表鸡蛋清中一些蛋白质用CM纤维素分离结果的分析级分中的蛋白质pI洗脱缓冲液的pH洗脱峰pH产量（mg）活性回收（%）A．拟卵粘蛋白3.9-4.34.34.342.287B．拟卵粘蛋白3.9-4.34.44.40.9C．卵蛋白A14.584.554.5173.889D．卵蛋白A24.654.754.6537.2E．卵蛋白A34.755.04.8511.0F．“球蛋白”5.55.23.6G．卵转铁蛋白6.5-6.86.05.842.587H．卵转铁蛋白6.5-6.86.76.116.1I．“球蛋白”8.58.07.5J．“球蛋白”9.59.32.4K．“球蛋白”10.09.41.1L．抗生物素蛋白>1010.09.50.939M．“球蛋白”10.09.91.2N．溶菌酶10.010.02.192第三节亲和层析

一、原理亲和力生物分子间存在很多特异性的相互作用，如抗原－抗体、酶－底物或抑制剂、激素－受体等，它们之间都能够专一而可逆的结合。分离原理通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。重组蛋白

用基因工程的方法引入特殊结合位点（如金属结合位点），将其加在重组目的蛋白的氨基端或羧基端。紧邻结合位点的位置加入蛋白酶切割位点，以便在用亲和层析纯化之后，将多余的蛋白质片段去掉。

二、亲和层析用基质具有较好的物理化学稳定性能够和配体稳定的结合结构为均匀的多孔网状结构与样品中的各个组分均没有明显的非特异性吸附

1、各类基质优缺点优点缺点纤维素价格低、活性基团较多非特异性吸附强、稳定性和均一性较差交联葡聚糖稳定性较好孔径较小、稳定性不好聚丙烯酰胺同上同上琼脂糖非特异性吸附低、稳定性好、孔径均匀适当、宜于活化多孔玻璃机械强度好，化学稳定性好活性基团较少、对蛋白质有较强的吸附作用

2、基质的活化溴化氰活化环氧乙烷基活化

指通过对基质进行一定的化学处理，使基质表面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。溴化氰活化

生成亚胺碳酸活性基团，它可以和伯氨(NH2)反应，主要生成异脲衍生物缺点：

非特异性吸附，影响亲和层析的分辨率。与配体结合不够稳定溴化氰有剧毒、易挥发，操作不便。

环氧乙烷基活化

活化后的基质都含有环氧乙烷基，可以结合含有伯氨基(NH2)、羟基(OH)和硫醇基(SH)等基团的配体优点

不引入电荷基团，与配体形成的N－C、O－C和S－C

键都很稳定，使用寿命长

缺点与配体偶联时需要碱性条件，温度为20~40℃，对于一些比较敏感的配体可能不适用多种商品化的活化基质

三、配体与待分离的物质有适当的亲和力与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性与基质稳定的共价结合自身应具有较好的稳定性配体的分类特异性配体只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合的配体

eg.抗原和抗体、酶和它的抑制剂

通用性配体特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大分子结合的配体

eg.凝集素可以结合各种糖蛋白

配体待纯化的蛋白质配体待纯化的蛋白质抗原特定单克隆抗体或多克隆抗体肝素凝聚因子、脂酶、结缔组织蛋白酶、DNA聚合酶单克隆抗体特定抗原胆固醇胆固醇受体、胆固醇结合蛋白蛋白质A/蛋白质G免疫球蛋白脂肪酸脂肪酸结合蛋白、白蛋白蛋白酶抑制剂蛋白酶核苷酸核苷酸结合蛋白、需核苷酸的酶磷酸磷酸酶苯基硼酸盐糖蛋白三嗪染料脱氢酶、激酶、聚合酶、限制酶、干扰素凝集素糖蛋白抗生物素蛋白含生物素的酶糖凝集素、糖苷酶蛋白质亲和层析中的合适配体四、基本操作选择适当的配体将配体固定化到基质上将目的蛋白混合液加样到基质上除去非特异性结合的蛋白质洗脱纯的目的蛋白1、上样层析柱较短，通常10cm左右样品液的浓度不宜过高上样时流速比较慢样品缓冲液中有一定的的离子强度上样时选择适当较低的温度2、洗脱特异性洗脱指利用洗脱液中的物质与待分离物质或与配体的亲和特性而将待分离物质从亲和吸附剂上洗脱下来。

非特异性洗脱指通过改变洗脱缓冲液pH、离子强度、温度等条件，降低待分离物质与配体的亲和力而将待分离物质洗脱下来。

特异性洗脱

优点：

特异性强，可以进一步消除非特异性吸附的影响，从而得到较高的分辨率。可避免蛋白质变性缺点：较常的时间、较大的洗脱条件。改善方法：选择亲和力强的物质洗脱、加大洗脱液浓度

特异性洗脱非特异性洗脱与配体亲和力较小

连续大体积平衡缓冲液冲洗，不影响活性，但洗脱体积较大，待分离物质浓度较低。配体结合较强时

适当的pH、离子强度洗脱，注意尽量不影响待分离物质的活性与配体结合非常牢固时

使用较强的酸、碱或在洗脱液中加入脲、胍等变性剂，使蛋白质等待分离物质变性，洗脱后再复性3、吸附剂的再生和保存

再生

用大量的洗脱液或较高浓度的盐溶液洗涤，再用平衡液重新平衡严重的不可逆吸附时，使用高浓度的盐溶液、尿素等变性剂或加入适当的非专一性蛋白酶保存

加入0.01%的叠氮化钠，4°C

下保存五、亲和层析用于蛋白质分离的实例

免疫亲和层析凝集素和糖蛋白亲和层析含有辅酶的酶类的亲和层析酶和蛋白类型抑制剂的亲和层析肝素为配体的亲和层析染料配体亲和层析金属螯合层析1、免疫亲和层析

小鼠血清不同亚型IgG的分离1m1的A蛋白SepharoseCL-4B柱用1.5mol/L的甘氨酸-NaOH，pH8.9的缓冲液(内含3mol／LNaCl)平衡

5m1小鼠血清同等体积的平衡液稀释后上柱

洗去不吸附的蛋白质

用不同pH的0.1mol/L柠檬酸洗脱

↓↓↓

2、凝集素和糖蛋白的亲和层析分离

凝集素是在自然界广泛存在的一大类糖结合蛋白。它们具有不同的糖结合专一性。利用天然存在的一些多糖和被固定化的不同糖链结构的糖蛋白，可以有效地分离纯化不同型的凝集素，也可应用固定化的凝集素分离纯化各种糖蛋白。用10mmol/L的磷酸缓冲液(pH7.0，含0.15mol/LNaCl)平衡酸处理的Sepharose6B(AT-6B)

天花粉的丙酮粉制剂用平衡液抽提后，上AT-6B柱洗去不吸附的杂蛋白

用0.2mol/L的半乳糖溶液洗脱花粉凝集素↓↓↓ⅰ.用含有半乳糖的天然多糖-琼脂糖的交联产物分离天花粉凝集素

ⅱ.糖蛋白亲和层析不同的糖蛋白具有不同的单相组分和糖链结构，它们和不同的凝集素呈现出不同的结合能力。常用的凝集素：

ConA、LCA

对甘露糖专一

WGA对N-乙酰氨基葡萄糖专一人血色素结合蛋白(hemopexin)的分离

用50mmol/L的磷酸缓冲液，pH7.0(含0.2mol/LNaCl)平衡固定化的WGA柱离子交换层析得到含有血色素结合蛋白和转铁蛋白的级分上柱平衡液洗脱不结合在柱上的转铁蛋白含有100mg／m1N-乙酰氨基葡萄糖的平衡液洗脱血色素结合蛋白↘↙↓↓回收率达91％

猪淋巴细胞质膜糖蛋白的分离1％的脱氧胆酸钠增溶膜蛋白

上固定化的LCA柱(1cm×8cm)

用1％的脱氧胆酸钠洗涤亲和柱，除去杂蛋白用含2％α-甲基甘露糖苷的1％的脱氧胆酸钠洗脱膜糖蛋白↓↓↓3、含有辅酶的酶类的亲和层析

很多的酶中都含有不同类型的辅酶，最为常见的是氧化还原酶和脱氢酶含有NAD。为此用固定化的NAD可以分离不同类型的氧还酶和脱氢酶，或激酶

↓↓↓固定化NAD柱

4、酶和蛋白类型抑制剂的亲和层析

一些酶及其抑制剂间存在着非常专一的相互作用。一些酶的抑制剂被固定化以后，就可用于一些酶的分离纯化。一些固定化的酶也被应用于蛋白类型的抑制剂的分离。为了避免位阻现象，在酶类的小分子抑制剂固定化时，常要插入一些不同长度的“手臂”，如插入8-9个原子胰蛋白酶抑制剂的分离纯化

部分纯化的牛卵巢胰蛋白酶抑制剂溶于2mlpH4.0的乙酸缓冲液

流经用同一缓冲液平衡的固定化胰蛋白酶柱

平衡液可洗去杂蛋白

用0.1mol／L的HCl，pH约1.2的溶液(内含0.5mol／LNaCl和10mmol/LCaCl2)洗脱胰蛋白酶抑制剂

↓↓↓大肠杆菌EcoPl的分离

将大肠杆菌抽提液经monoQ柱和固定化的肝素柱纯化至80%纯度上用特定序列(AGACC)的寡脱氧核苷酸和溴化氰活化的交联琼脂糖偶联成的亲和层析柱用10体积平衡液(10mmol/LTris-HCl，pH7.6，0.3mol/LNaCl，lmmol／LEDTA)充分洗涤用2体积的lmol/LKCl解析吸在亲和柱上的EcoP1↓↓↓5、肝素为配体的亲和层析

肝素是蛋白聚糖中的一种，可以和许多类型的蛋白质结合。6、染料配体的层析

染料树脂不专一的亲和介质优点稳定、和许多类型的酶结合，但又不被酶所作用、价格低廉

eg.Cibacron蓝F3GA酵母中含有NAD酶的分离

面包酵母抽提液加入硫酸铵至75％饱和度，离心后，取220mg沉淀溶于10m1起始缓冲液流经用起始缓冲液平衡的蓝色交联琼脂搪凝胶CL-4B柱

pH8.6的缓冲液中加入10mmol/L的NAD+洗脱甘油醛-3-磷酸脱氢酶在起始缓冲液中加入5mmol/LNAD+洗脱醇脱氢酶在起始缓冲液中加入20mmolNADP+洗脱葡萄糖-6-磷酸脱氢酶洗脱液的pH升至8.6时，解析己激酶↓↓↓↓↓碱性磷酸单酯酶的分离

小牛小肠粘膜抽提液用DEAE离子交换纤维素除去部分杂蛋白酶活性的级分再上平衡的活性染料艳蓝K-GRS和交联琼脂糖4B偶联的染料层析柱平衡液洗除杂蛋白含有0.1mol/L磷酸盐的缓冲液可洗脱碱性磷酸单酯酶再吸附在活性染料Procion红HE-33与交联葡聚糖凝胶G-100偶联的基质柱上用含有0.1mol/L磷酸盐的缓冲液对缓冲液梯度洗脱，酶活性出现在5mmol/L磷酸盐浓度时↓↓↓↓↓回收率62％回收率96％

7、金属螯合层析

基于蛋白质的组氨酸咪唑基和半胱氨酸巯基能与铜、锌、镍离子间形成稳定的螯合物而进行分离的。人铜锌超氧化物歧化酶的分离

酶纯化34倍，活力回收92％酶纯化2000倍，活力回收约58％人红细胞浓缩裂解液上DEAE-CL-交联琼脂糖凝胶-6B柱

纯化的酶液流经固定化的亚氨基二乙酸柱

用20mmol/L乙酸缓冲液，pH5.0洗涤层析柱

用同样浓度和同样pH的柠檬酸缓冲液洗脱人铜锌超氧化物歧化酶

↓↓↓人血浆中α2巨球蛋白(α2M)

的纯化

人血浆经硫酸铵分级后，取40％-55％的级分过Zn配位的固定化亚氨基二乙酸柱洗脱不吸附的蛋白质用20mmol/L磷酸缓冲液，150mmol／LNaCl,pH5.0溶液洗脱α2M↓↓↓第四节凝胶过滤

凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等，依据是多孔的载体对不同体积和不同形状分子的排阻能力的不同，从而对混合物进行分离。优点：凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，温度范围广，不需要有机溶剂，分离效果好缺点：样品被不断稀释，上样量不能太大，否则分辨率变差一、原理

凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，小分子可以进入凝胶网孔，而大分子则排阻于颗粒之外。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱1、体积参数分子在柱中移动的速度取决于该分子在固定相和流动相间的分配系数Kd，Kd表示某一分子在特定的凝胶柱内的洗脱行为。Kd＝(Ve一Vo)／ViVe

洗脱体积Vo外水体积Vi内水体积Ve=Vo该成分的分子全部被排阻在凝胶颗粒的间隙中，因而洗脱速度最快。即该成分的Kd＝0。Vi＝Ve-Vo该成分不被排阻而可完成进入凝胶颗粒内部,

因而洗脱速度最慢。即该成分的Kd=l。Kd值介于0-l之间，物质的洗脱速度随其Kd值的增加而降低一般物质的Kd值是0<Kd<l。

洗脱行为可以有三种可能的情况:

凝胶Kd＝0Kd=l0<Kd<l2、影响分离效果的因素流速加样体积样品浓度离子强度①流速

影响洗脱液流速的因素洗脱液加在柱上的压力

为保持层析过程中恒定的压力，可使用恒压瓶。凝胶交联度凝胶颗粒大小

流速过低样品横向扩散增大，峰变宽，分辨率降低，洗脱时间长流速过高

洗脱峰重叠，柱压增大，分离效果变差线性流速控制在2～10cm/h②加样体积体积过大

平台洗脱峰或相邻峰重叠体积过小目的蛋白收集量少、稀释倍数大、浓度低③样品浓度进样前，样品应高度浓缩，浓度为10～20mg/ml分组分离&脱盐除杂适当提高样品浓度分级分离&分析性实验浓度低④离子强度可防止蛋白质与蛋白质之间或与凝胶介质之间的相互作用常用盐溶液：

20-100mmol/LNaCl浓度过高引起凝胶柱床体积变化二、凝胶过滤层析的介质

葡聚糖系列琼脂糖系列聚丙烯酰胺系列多孔硅胶1、葡聚糖系列以微生物产生的葡聚糖Dextran为原料用环氧氯丙烷为交联剂，在碱性条件下交联而成商品的凝胶，称为Sephadex先制成丙烯基的衍生物，然后再用N，N’-甲叉双丙烯酰胺交联，得到商品化的凝胶，被称为Sephacryl

2、琼脂糖系列

较常用的是Pharmacia和BioRad两家的产品，前者生产的称为Sepharose，后者的产品为BioGelA。BioGelA系列的产品有不同的颗粒度，有粗、中和细三档，它们的颗粒度分别为l50μm～300μm，80μm～150μm和40μm～80μm。

3、聚丙烯酰胺系列由丙烯酰胺单体和双丙烯酰胺混合物聚合得到的多孔性物质。产物也是固体粉末，用前先溶涨。

4、多孔硅胶优点：

物理化学稳定性高，耐热耐压，使用寿命长缺点：

柱效较低、表面具有离子性，对蛋白质有吸附性、不能在强碱性环境中使用刚性亲水性填料，具有一定直径的多孔网状结构的球状颗粒三、基本操作

凝胶的选择凝胶柱的制备上样洗脱凝胶柱的重复使用与保存1、凝胶的选择

分组分离

根据样品中的大分子和小分子分配系数上的显著差异，将其分开。可选用SephadexG-25和G-50

小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用SephadexG-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4。分级分离

将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离。选用分级范围较窄的凝胶，且中间值接近于目的蛋白的分子量

颗粒大小的影响优点缺点小颗粒分离效果好流速慢分离时间长大颗粒流速快区带扩散洗脱峰平而宽2、凝胶柱的制备

用于分组分离

短而粗L/D值＜10

用于分级分离

L/D值比较大对很难分离的组分一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1～5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。柱L/D值的选择装柱前，凝胶基质用蒸馏水或洗脱液中充分溶胀。凝胶柱填装后通常可以采用一种有色的物质，如蓝色葡聚糖-2000、血红蛋白等上柱，以检测凝胶柱的均匀程度。3、上样粘度因素粘度过大，分子因运动受限制，影响进出凝胶孔隙，洗脱峰形宽而矮，有些可分离的组分因此重叠。分级分离

加样体积约为凝胶柱床体积的1％～5％左右分组分离

加样体积约为凝胶柱床体积的10％～25％

4、洗脱水

分离不带电荷的中性物质电解质溶液（酸、碱、盐的溶液）

分离带电基团的样品水与有机溶剂的混合液（水-甲醇、水-乙醇、水-丙酮）

用于吸附较强的组分洗脱液5、凝胶柱的重复使用与保存当样品的各组分全部洗脱下来之后，即可以加入新的样品，继续使用。保存液相中保存：于凝胶悬液中加入防腐剂或高压灭菌后

4℃保存。在半收缩状态下保存：60%-70%酒精液洗冲，凝胶体积缩小干燥状态保存：长期不用，水洗净后，用含乙醇的水洗，逐渐加大乙醇用量，最后用95%的乙醇四、凝胶层析的应用

脱盐分离提纯测定高分子物质的分子量高分子溶液的浓缩蛋白质复性研究1、脱盐高分子溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。优点：操作简便、快速、蛋白质和酶类等不易变性适用的凝胶：

SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6

用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡上样用同样缓冲液洗脱收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类蛋白质不会因为脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上

2、分离提纯凝胶过滤的载体可以根据它们的孔径分为很多种不同的规格。每种规格都有其特定的分级的范围，一旦超出分组范围，不论是其上限还是下限，即使分子量有大有小，但载体的排阻情况基本相同，就不能分离。在凝胶过滤层析时，要根据所要纯化的样品的分子量选择所用的凝胶过滤的基质。天花粉毒蛋白的凝胶过滤分离交联葡聚糖凝胶G-50柱(1.8cm×100cm)用50mmol/LTris-HCl,pH7.8缓冲液平衡天花粉硫酸铵糊(90％饱和度的沉淀)溶于2m1平衡缓冲液中上样洗脱天花粉毒蛋白除去不溶物↓↘↘↓

3、测定高分子物质的分子量测大于所用载体上限分子的洗脱体积测小于下限的分子的洗脱体积标定凝胶过滤柱的Vo标定凝胶过滤柱的Vi测定一系列已知分子量的标淮样品在柱上的洗脱体积Ve以(Ve-Vi)／(Vo-Vi)和1ogMw作图测得了待测分子量的样品的Ve由(Ve-Vi)／(Vo-Vi)从标准曲线上可以求得未知样品的分子量蓝色葡聚糖氨基酸、有色盐类↓↓↓↓↓↘↙以标准样品的分子量的1ogMw对Ve作图or

洗脱液中蛋白质浓度4、高分子溶液的浓缩将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外离心或过滤，去除溶胀的凝胶浓缩的高分子溶液↓5、蛋白质复性研究变性蛋白加入凝胶柱高浓度变性剂存在，蛋白呈无规则卷曲变性蛋白体积大，只能进入颗粒间隙，迁移速度快变性剂分子量小，进入颗粒内部，迁移速度慢缓冲液洗脱蛋白变性剂浓度降低，转成复性缓冲液变性蛋白复性，以天然形态洗脱出柱↓↓↓↓↓↓第九次课第五节疏水层析一、原理

疏水作用层析（HIC）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。

疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。

WatermoleculesSoluteSurfaceexposedhydrophobicgroupsLigandWatermoleculesinbulk二、疏水配基

烷基链配基芳基配基

高分子配基

柱：HiPrep16/10

样品:细胞色素C(1),溶菌酶（2），核糖核酸酶（3），靡蛋白酶原（4）三、疏水基质人工合成聚合物类琼脂糖纤维素聚苯乙烯聚丙烯酸甲酯类多糖类壳聚糖

应用最广泛

良好的生物相容性和化学稳定性

最常用：正辛基-交联琼脂糖凝胶更强的疏水作用，一些疏水性较强的蛋白质被吸附后不易解析苯基-交联琼脂糖凝胶

应用于疏水性较强的蛋白质

四、基本操作

平衡

Equilibration上样

Sampleapplication洗杂Washing洗脱ElutionEquilibration1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionWatermoleculesHydrophobicligandGelmatrixSampleapplication1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionGelmatrixProteinsHydrophobicgroups

Washingoutunboundmaterial1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionConc.saltAbsNon-boundproteins1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionElutionTargetelutesConc.saltAbsElution1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionConc.saltAbsMorestronglyboundp