第五章 固定化酶和固定化细胞(下)新

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酶工程第五章固定化酶第一节概述第二节酶固定方法第三节微生物、植物、动物细胞的固定方法第四节固定化原生质体和辅酶第五节固定化酶的性质第三节微生物、植物和动物细胞固定化

细胞特性比较固定化细胞的特点类型：微生物细胞、植物细胞、动物细胞生理状态：死细胞（完整细胞、细胞碎片、细胞器）活细胞（增殖细胞、静止细胞、完整细胞）形状：颗粒状、块状、条状、薄膜状或不规则形状。最多使用：颗粒状珠体使用周期：理论上讲，固定化增殖细胞保持了细胞原有的全部活性，只要载体不解体，不污染就可以长期使用。概念：固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞.该细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。缺点：只适用于胞内酶，而且细胞中的酶很多，可能产生副反应，使产物不纯。细胞膜和细胞壁对底物和产物的扩散也产生限制，降低了反应速度。优点：直接将微生物细胞固定化，不仅可以免去提纯酶的步骤，而且酶处于天然环境，活力高，稳定性好，还可利用细胞中的多酶体系，催化复杂的多步反应。细胞固定化方法吸附法包埋法热处理法：适用于热稳定性较好的酶的固定，可与交联法或其他固定法联合使用。酶和细胞固定化示意图吸附法主要通过载体与细胞间的静电引力，即细胞表面与载体之间范德华作用力，离子键和氢键作用力，才使细胞固定在载体上的。

包埋固定法

在细胞自身并不与凝胶基体发生化学键合的情况下将其包埋在半透性聚合物颗粒（或膜）内的一种固定化方法。包埋法的最大优点是能较好的保持细胞内多酶系统的活力，可象游离细胞那样进行产物的发酵生产。包埋法分类常用载体：琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺

常用凝胶包埋法举例：海藻酸钙包埋法

基本操作是：称取一定量的海藻酸钠配成水溶液，经杀菌冷却后，与一定体积的细胞或孢子悬浮液混合均匀，然后用注射器或滴管将冷悬液滴入一定浓度的凝固浴中（常用CaCl2溶液），形成球状固定化细胞。通过改变载体溶液参数包埋细胞

改变载体溶液、操作温度、盐浓度、pH值和溶剂等参数时，亦可使其转变为凝胶状态，将细胞包埋其中。研究热点——光交联树脂包埋法

例：相对分子量为1000-3000的光交联聚氨酯预聚物等，加入1%左右的光敏剂，加水配成一定浓度，加热至50℃，然后与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，摊成一定厚度的薄层，用紫外照射3min，就可制得。固定化死细胞（热处理）：

对于耐热性较好的酶，分离得到菌体后，经过一定温度热处理后，使菌体内的自溶酶系失活，细胞结构固化，目的酶被固定的细胞内。

此法比较简单，不需要载体，也无需分离制取酶。耐热性酶：耐热性脂肪酶第四节固定化原生质体和辅酶一、原生质体的制备二、固定化三、举例四、辅酶固定化一、原生质体的制备将对数生长期的细胞收集——悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中——加入水解酶——分离——得到二、原生质体固定化的方法将原生质替制备好后，把离心收集到的原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中，配成一定浓度的原生质体悬浮液，然后采用包埋法制成固定化原生质体。三、辅酶固定化1原因有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化反应有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生有机辅因子价格昂贵——工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生辅酶固定化的方法：2固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亚胺法以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当的化学修饰后固定在超滤器中。3辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍。

辅酶的固定化辅酶的固定化辅酶固定化的形式：第五节固定化酶的性质

及其影响因素一、影响固定化酶性质的因素二、固定化后酶性质的变化三、评价固定化酶的指标一、影响固定化酶性质的因素1．酶本身的变化分子构像的变化：主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。一、影响固定化酶性质的因素2．载体的影响（1）位阻效应（2）微扰效应（3）分配效应（4）扩散限制效应3.固定化方法的影响二、固定化后酶性质的变化1．固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反应速度下降原因：酶结构的变化载体与酶活性中心重要氨基酸酶与底物空间位阻二、固定化酶的性质酶固定化后，从游离状态变为结合状态，其性质也随之发生变化。具体有以下变化：（一）稳定性增加：固定化酶稳定性一般比游离酶有所提高。具体表现在以下几个方面：1.热稳定性提高。2.使用稳定性提高。半衰期一个月以上，具有工业应用价值。3.保藏稳定性提高。4.抗变性剂能力提高。5.抗蛋白酶水解。esp：固定化的酶可长时间连续使用，如包埋的乳酸脱氢酶在37℃下连续作用10小时不失活，而游离酶在同样条件下作用2小时即失活90％。使用稳定性提高可延长酶的使用寿命，降低成本。

esp：酶与载体结合后，可以长期保存。如游离的胰凝乳蛋白酶在pH4.1，4℃保藏4个月后残留的活力只有2％，而偶联于琼脂糖后经同样处理可残留82％的活力。这对酶制剂的贮存和运输有重要意义。esp：将巨大芽孢杆菌青霉素酰化酶固定到聚丙烯腈纤维载体上。将酶于0.05mol／L的磷酸缓冲液（pH7.5）中分别在不同温度下保温6小时，测定酶活力。固定化酶在50℃以下稳定，天然酶在40℃以下稳定。固定化酶的热稳定性优于天然酶。1.固定化酶；2.天然酶

酶固定化后，抗变性剂（尿素、盐酸胍、有机溶剂等）能力提高，甚至在一定条件下出现激活。固定化酶对蛋白酶的水解作用的抵抗力也比天然酶高。见下表：

残留活力（％）

天然氨基与DEAE-纤维素与DEAE-葡聚糖酰化酶结合的酶结合的酶胰蛋白酶233387蛋白酶-P4853882、固定化后酶稳定性提高的原因：a.固定化后酶分子与载体多点连接。b.酶活力的释放是缓慢的。c.抑制自降解，提高了酶稳定性。（二）最适条件变化1.固定化酶的最适pH变化酶固定化后，对底物的最适pH和pH活性曲线常常发生偏移。一般说来，用带负电荷载体（阴离子聚合物）制备的固定化酶，其最适pH值较游离酶偏高。反之，使用带正电荷的载体其最适pH值向酸性偏移

pH对固定化前后天冬酰胺酶活力的影响1.固定化酶；2.游离酶pH对酶活性的影响：（1）改变酶的空间构象（2）影响酶的催化基团的解离（3）影响酶的结合基团的解离（4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。pH对固定化酶的影响1）载体带负电荷，pH向碱性方向移动。载体带正电荷，pH向酸性方向移动。

微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液称为宏观环境。pH的变化2）产物性质对体系pH的影响催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离酶的pH值高；反之则低。2.最适温度变化固定化酶的最适温度一般比游离酶高，提高的程度与载体性质有关。如氨基酸酰化酶固定于DEAE-纤维素，最适温度提高7℃，固定于DEAE-葡聚糖可升高12℃，达72℃。

一般温度每升高10℃，反应速度可提高1－2倍，所以固定化酶可在较高温度下催化，从而加快反应速度。而且在较高温度下反应还可避免微生物污染。（三）专一性的变化

催化小分子底物的酶固定化后专一性一般不变，但底物为大分子的酶，如淀粉酶、蛋白酶等，固定化后专一性可能发生变化。其产物可能与游离酶不同，应用时需注意。

糖化酶用CM－纤维素叠氮衍生物固定后，相对分子质量8000的直链淀粉的活性为游离酶的77％，相对分子质量50000的只有17％。（四）相对活力的变化

固定化酶的活力在多数情况下比天然酶小，其专一性也能发生改变。例如、用羧甲基纤维素作载体固定的胰蛋白酶，对高分子底物酪蛋白只显示原酶活力的3%，而对低分子底物保持不变。所以，一般认为高分子底物受到空间位阻的影响比低分子底物大。（五）米氏常数的变化固定化酶的Km与游离酶的Km有些变化，有些变化很大。使用载体结合法制成的固定化酶Km变化的原因，有时主要是载体与底物间的静电作用的缘故。三、评价固定化酶的指标1.固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。2.操作半衰期：衡量稳定性的指标。连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2）t1/2=0.693t/2.303log(E