分子生物学课件第3章

第3章DNA复制

(DNAReplication)3.1.基本概念3.2.复制起点与方向

3.3.Semi-ConservationReplication

3.4.复制的方式

3.5.线状DNA的复制3.6.DNA复制的基因与酶类体系

3.9.MethylationofDNA3.7.DNA复制的调控3.8.核小体的复制3.1.基本概念

(BasicConcept)遗传物质的分子机制分子生物学的核心Watson&Crick:

一种遗传物质，必须能行使两种功能，即自我复制和对细胞的高度特异性的影响遗传物质的基本属性：基因的自我复制基因的突变控制性状的表达DNA复制

亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以每单链DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTP,合成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代DNA分子的过程。●Replicon;●Replisome;AunitofthegenomeinwhichDNAcontainaregionfromorigintoterminator

Themultiprotein(30±)structurethatassemblesatreplicatingforktoundertakesynthesisofDNA

复制机理的复杂性D.S.DNAS.S.DNA能量的供求构型的变化超螺旋线状，开环状多种酶类的互作ReplisomeDNA复制起始控制机理知之甚少复制的准确性（修复，校正）研究试材的特殊性（温度敏感型ts，突变抑制体系Su）DNA复制速度(E.coli105bp/min，高速解旋112km/h?)缺乏统一的模式(D.S.DNA,S.S.DNA,LinearDNA….)

3.2.复制起点与方向（replicationorigin&direction）

isolationoforiC复制起点的特征J.W.Zyskind克隆到E.colioriC确定其最小区段为245bp，并与沙门氏菌等4钟细菌的oriC序列进行比较分析发现；245bpminimaloriginofreplicationrichAT&DNApolymerase(DnaA)bindingsiteoriCRNApol发动primer真核生物复制起点的研究是以酵母为基础的ATrich

“呼吸现象”

DNA复制原点处氢键迅速断裂与再生，导致两条DNA链不断解链与聚合，形成瞬间的单泡状结构的过程。

在富含AT的区域内尤为明显

replicationorigin

两侧基因的转导频率高

4a4b3c3d2e2f1g1haobcaobdecaobdfgecaobdfh

复制的不同步性断裂的随机性MostrDNAarelocatedneartheoriginofreplication

复制的多模式单起点、单方向多起点、单方向单起点、双方向多起点、双方向1963Cairns37℃,5ci/mMH3-T,6min37℃,52ci/mMH3-T,6min42℃,

T,onecircle复制多模式的证据模式？E.coli

thy-slow-stopmut.ts复制发动温度敏感突变型42℃不能发动DNA复制、但可完成DNA延伸慢停突变(slow-stopmutation）当温度升高，复制停止在下一周期开始快停突变(fast-stopmutation）当温度升高，复制立即停止单起点、双

方向R.L.RodriguezE.colithy-slow-stopmut.ts42℃37℃,

5ci/mMH3-T,20min37℃,52ci/mMH3-T,45min子链DNA延伸方向DNApolymerasereactsonthe3’endonlyOHTCATCA

COH3’NewDNAelongationfrom5’to3’directionpppOHC++ppi

进化中保留的深刻的、选择与适应的、化学及功能的根源5’PPP5’PPP如果DNA的延伸方向是3’→5’

ATCG

+

5’pppOH3’G

pppOHG

ATCG

5’pppOH3’ATCG

+

5’pppOH3’

G

pppOH

G

5’ppp因能量的需要，DNA的5’端必须带有PPP游离dNTP具有ppppppOH3’ATCG在0.2MNacl的生理环境中，磷酸基团间的强电负性，使dNTP难以聚合到DNA的5‘端，而且双链DNA的5’端碱基配对困难需要其他机制以解脱碱基发生错配后的校正……费时、费能、增加脱磷酸、加磷酸的能量消耗

A

TCGpppOH+pppApOHTCGpppOHTCGTCGpppOH3.3.DNA的半保留复制（Semi-ConservationReplication）

Threereplicationhypotheses(CsClgradientcentrifuge)

N15

N14DNASemi-ConservationReplicationM.MeselsonandF.W.Stahl,Sciences44:675,1958.3‘5‘3‘5‘OK!How?5‘3‘5‘3‘a)Okazakifragment1968ReijiOkazakiE.coli[t-]2’’,7’’,15’’,60’’pulse-labelingindT-H3

stopinKCN0℃D.S.DNAS.S.DNADensitygradientofsucroseMeasureH3-T

pulse-chase20℃indT-H3

30’’transfertodTthencontinueH3-Tpulse-chase

pulse-labeling120’’60’’15’’7’’2’’10S(1kb)40S(Prok.400Nt/sec)DNAreplicationinOkazakifragment1kb5‘3‘5‘3‘DNAreplicationinOkazakifragment1kb5‘3‘5‘3‘（semi-discontinuousreplication!）

？半不连续复制（semi-discontinuousreplication）

证据

dumpfragmentinDNAdUTP:dTTP=1：300incell

---A-------T--------G--------C----AUGUdutgenedUTPase少数dUTP

DNA中不能有U?---A-------T----突变频率=1/1200

！？---A---

---A---

---U------

---UngaseungU尿嘧啶-N-糖基酶UUdenaturedumpfragment~1200base~Okazakifragment●

ung–

dumpfragmentlonger●dut

–

dumpfragmentshorterAApulse-labelingindT-H3？leadingstrand(indUMPF.)laggingstrand（inO.F.）Lig(ts)？直接证据？DNAsemi-discontinuousreplication

leadingstrand,laggingstrand均有dUMP

的掺入

Okazaki片段在某种意义上为

dUMP

片段先导链按dUMP

片段连续复制后随链按Okazaki片段不连续复制(Prok.1-2kb,Euk.0.1-0.2kb)3.4.DNA复制的方式

(DNAreplicationmodel)

primer

DNA聚合酶不能发动子链DNA的复制起始!E.coli[Rifs][RifS]+M13E.coliE.coli[RifR]M13+S.S.DNAvirus+RF无M13RFRifampinM13Rifampin有M13RF有M13RF

M13Rifampin

Rifampin

是E.coliRNApolymerase

的抑制剂

M13RF的形成需要RNApolymerase发动合成一段RNA分子作为引物

RF启动后，RNA引物已经形成,Rifampin

的抑制无效ConclusionThefirstevidencesupportingRNAprimingBeforeDNasedigestionAfterDNasedigestionDNA/RNAprimerlabeledtheintactprimersontheOkazakifragmentswith[32p]GTP.destroyedDNAwithDNase,leavingonlythelabeledprimers.

genotype

RNaseHDNaseaande;

-+bandf;+-candg;

--dandh;++DNasecannotcompletelydestroyOkazakifragmentsTunekoOkazakiJ.Mol.Biol.184(1985)p.4913merRNAprimerlabeledwithP32●新起始方式（denovoinitiation）或复制叉式（replicationfork）

startingpoint(Cairnsmodel,θform,thedaform)→RNAprimer→transcriptionactivation→leadingstrand→fork→laggingstrandmultiplerepliconEukaryote(500-5000bp/min)DNA复制的转录激活(transcriptionalactivation）RNApolymerase[RifS]10NtRNAprimerforleadingStrand

origindnaGprimase

[RifR]forlaggingStrand

primasome

SynthesisofprogenystrandinlaggingDNApppRNAasprimerDNApolymeraseIIIpppDNApolymeraseIDNApolymeraseIDNAligase

RNApol(RNApolymerase)[RifS]

dnaG(primase)[RifR]

完成对后随链引物的合成

完成10±NtRNA引物合成后.

DNApol

III

进行DNA链的延伸

DNApolI对RNA引物切除并聚合填补

连接酶(ligase）将Okazaki片段，

dUMP

片段连接完成对先导链引物的合成实现DNA复制的转录激活起始较先导链的启动落后一个Okazaki片断Conclusion●共价延伸方式（covalenceelongation）

或滚环方式

（rollingcircle）D.S.DNA→Nick→leadingStrand→Elongation→rolling→LaggingStrand(δform,deltaform)5‘3’3’3‘共价延伸方式transcriptionalactivation?●置换式（Displacementform）

D.S.DNAInmitochondrialDNAalsoinchloroplastDNA

→S.S.DNAastemplate→NewS.S.DNA→Displacement→D-Loop复制叉两侧DNA双螺旋的解旋E.coliC/genome=4.2X106bp30-40’/每次复制历时10bp/每圈螺旋84000-105bp/min解旋

(8400-10000rpm!高速离心机)能量？复制叉两侧DNA双螺旋的解旋DNAtopoisomeraseIDNA的单链瞬间断裂（transientsingle-strandbreak）缓解高速旋转，引入正向超螺旋，解出overwinding的应力DNAtopoisomeraseIIDNA的双链瞬间断裂（transientdouble-strandbreak）缓解高速解旋时，DNA双链的相互缠绕引入负超消除复制叉移动时产生的正超DNAHelicase(DNA解旋酶）ATpase活性，解除1氢键／水解2ATPTopI,TopIIHelicase(repprotein)SingleStrandBindingprotein(SSB)Helixdestabilizingprotein(HDP)DnaBpriteinDnaCproteinPrimase（dnaG）Ung-aseDNAPolymeraseIII

DNAPolymeraseI

Ligaseforprimosome复制体进化中形成了灵活的多酶复合体replisome进化中形成了灵活的多酶复合体replisome位于复制叉处的多酶复合体完成

laggingStrandDNA延伸时

必须快速从一个冈崎片段移到另一冈崎片段InlaggingStrand多酶系统必须完成多次反复的启动与扩展

E.coli

启动2000—4000次的冈崎片段复制Replisomemodel(后随链的回环模式)ReplisomeincovalenceelongationSSB3.5.线状DNA的复制及避免5’末端短缩的模式

（5’-endshorten）

3’-OH?

3‘-OHLaggingstrandofcircleDNAreplicationLaggingstrandoflinearDNAreplicationBut3‘5‘5‘3‘3’-OH?

WatsonJ.DT7phage

DirectrepeatintheendoflinearDNA

ConcatermerbetweentwooffspringDNAafterreplication

(100dNtterminalredundancy)??concatermer3‘-OHATCGTAGCATCGTAGC3‘-OHb)ReplicationoflinearAdnovirus-2DNA

35937bp

pTP

C

G

IR103-162

IR;including50bpreplicationorigin

richAT&1thC/Ghighconversation

pTP;pre-Terminalprotein80kd→

TP55kdSSB;S.S.DNAbindingprotein72kdAd2DNApolymerase;

140kd

复制起始复合体引发复制（不需引物）

避免5’-endshortenpTp-Ser-dCMP

CG●过程SSB+ATPDNA末端解链

TPpTP-Ser+

dCTP

pTP-Ser-dCMP

3‘OHIRIRCGGCGCCGpTP-Ser-dCMPReplacedS.SDNA

HairpinPanhandlepTP-Ser-dCMPG3’G3’G3’TPc)真核生物染色体DNA末端补齐模式

●端粒的发现

1938MullerX-rayDrosophila

末端极少发生缺失和倒位推测染色体两端存在特殊结构，使染色体趋于稳定.并定名为Telomere

1938B.McClintock

顶端缺失染色体易于融合，而正常染色体不易连接。推测染色体末端具有特殊端粒结构。1970s分子生物学发展端粒研究获得突破pBR322PvuBg1ARSTELTELBamH1BamH1四膜虫rDNABg1PvuBamH1转化酵母Pvu传代酵母TEL？！ShampayJ.&Blackburn加尾实验转化酵母

传代酵母TELPvu酶切连接Pvu酵母DNAPvu酵母TEL酵母TEL？！端粒的模板链在何处?端粒酶的发现为揭示端粒序列复制的模板及避免5’端短缩的机制奠定了重要的基础

端粒的模板链在何处?加尾实验未能证明延伸端粒序列的模板从何而来？

●端粒DNA(Telomere)

TTGGGG(T2G4)序列高度重复的末端

5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG3’(richGchain)

3’AACCCC

AACCCCAACCCC5’(richCchain)

●1985.CarolGreider&Blackburn,

1986.Gottchling尖毛虫telomerebindingprotein–155kdtelomerebindingprotein–226kd四膜虫telomerase游扑虫

telomerase+100bptelomere

200－500KDaRNACAAAACCCC链+具有逆转录酶活性的

末端结合蛋白(TBP）

1990Yu和Blackburn在体外加尾实验的反应体系中

加入这段RNA区域的反义序列GTTTTGGGGTTG证明端粒酶中CAACCCCAA序列是端粒重复序列（GGGGTT）n合成的模板端粒酶的加尾功能受到明显抑制1990Yu和Blackburn在体外加尾实验的反应体系中证明端粒酶中CAACCCCAA序列是端粒重复序列（GGGGTT）n合成的模板转化四膜虫后代的染色体端粒出现了突变序列的端粒对CAACCCCAA序列进行诱变

model

TBPisReversetranscriptase-like

RNAcomplementwith3’endofDNA&astemplateforcDNA

ElongatedT2G43’-endasprimerfor5’-endDNAsynthesisG链

–T2G4-----TTGGGGTTGGG

C链--A2C4----

telomerase

3’

aaaAACCCCAACuuac---5’TTGG链

–T2G4-----GGTTGGG

C链--A2C4----TTG

telomerase

3’

aaaAACCCCAACuuac---5’GGGTTGG链

–T2G4-----GGTTGGG

C链--A2C4----TTGGGGTTG-------------

telomerase

3’

CCAACCCCAACCCC---5’

telomerase

3’

CCAACCCCAACCCC---5’WhenG-richstrandislongerenough

telomerase

3’

aaaAACCCCAACuuac---5’GGhoogsteenbond

Tetraplexhelix

G链–T2G4-----TTGGGG

TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG

C链--A2C4-----G链–T2G4-----TTGGGG

ttggggttgC链--A2C4-----AACCCCAAggggttgggPrimaseAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCCDNApolorIdentificationoftelomeraseactivity.ClustersofbandsRepressentsanadditionofonemoreTTGGGGprimer四膜虫无细胞提取物,并与人工合成的四重TTGGGG端粒重复序列寡聚物一起孵育90分钟，加入标记或未标记过的核苷酸，产物进行电泳检测。泳道9－12为Klenow片段泳道13－16为细胞提取物，但不含引物。泳道1-4行中每一行含有一种标记的核苷酸和三种其余的未标记核苷酸。第1行是标记的dATP，只显示出涂抹，第第2和4行没有显示出延伸的合成端粒。但是第3行，是标记的dGTP，显示出明显的周期性端粒的延伸。第5-8行是实验中含有一个标记的核苷酸和只有一种未标记的核苷酸，这个实验证实了dGTP能够被进入端粒，而且在只有dTTP未标记的情况下dGTP也能够被进入端粒。结果：端粒链只含G和TTelomeraseactivity

isrepressedinsomaticcellsofmulticelluarorganismsresultinginagradualshorteningofthechromosomewitheachcellgeneration.Asthisshorteningreaches

informationalDNA,

thecellssenesceanddie.细胞分裂端粒阈值informationalDNA细胞停止分裂或死亡Whentelomeraseactivity

isrepressed人体发育完成，端粒酶被抑制，细胞分裂次数与端粒长短呈正比细胞分裂端粒阈值端粒长短端粒酶活

Harley(1989)端粒的重复片段为探针检测胎儿细胞株婴儿细胞株青年细胞株老年细胞株年龄小大端粒长度长短早衰性侏儒症的端粒明显较正常人短“多莉”的衰老＞研究端粒（记时器）丢失的速率/年，预测人类的寿命XXXYwhy?生殖细胞、癌细胞的繁殖(端粒酶的激活！细胞得以永生！)随着组织、细胞的老化染色体端粒的长度变短小麦不同细胞内端粒长度的变化TheterminationofDNAreplicationE.coli(单起点双方向)两复制叉的相遇处具有多个终止位点(不是复制叉简单相遇）terE