基因治疗课件最新版

危敏副教授南方医科大学基因工程研究所基因治疗危敏副教授南方医科大学基因治疗药物治疗手术治疗放射治疗理疗传统治疗方法新的生物治疗：

基因治疗(genetherapy)药物治疗传统治疗方法新的生物治疗：基因治疗一、概念二、策略三、基本流程四、应用与展望基因治疗一、概念一、基因治疗的概念一、基因治疗的概念概念的发展经典概念：将具有正常功能的基因置换或增补患者体内的缺陷基因，从而达到治疗疾病的目的。广义概念：将某种遗传物质转移至患者细胞内，使其在体内有效表达，最终达到治疗疾病目的的方法，均称之为基因治疗。概念的发展经典概念：将具有正常功能的基因置换或增补患者体内的二、基因治疗的策略

(一)直接策略：针对致病基因(二)

间接策略：导入与致病基因无直接联系的治疗基因二、基因治疗的策略(一)直接策略：(一)直接策略基因矫正（genecorrection）基因置换（genereplacement）基因增补（geneaugmentation）又称为补偿性基因治疗4.

基因干预（geneinterference）又称为反义基因治疗(一)直接策略基因矫正（genecorrection）基因矫正（genecorrection）指将致病基因的突变碱基加以纠正，而保留正常部分。基因置换（genereplacement）指通过同源重组（基因打靶）技术，将正常基因定点整合到靶细胞基因组内，以原位替换致病基因。不涉及基因组整体改变的情况下对缺陷基因进行精确的原位修复，是最理想的治疗方式。基因矫正（genecorrection）基因打靶技术

指目的基因导入靶细胞后，通过目的基因与靶细胞内染色体上同源DNA序列间的交换，将目的基因定点整合到靶细胞基因组上某一确定位点的技术。基因打靶技术指目的基因导入靶细胞后，通过目的基因与3.

基因增补（geneaugmentation）

成熟的策略

是指不去除异常基因，将有功能的正常基因导入病变细胞或其它细胞后发生非定点整合，表达正常产物以补偿缺陷基因的功能，或使原有的功能得以加强。3.基因增补（geneaugmentation）4.基因干预（geneinterference）是采用特定的方法，导入外源基因选择性地阻断、干扰、抑制和封闭有害基因在DNA、RNA和蛋白质水平的表达及其生物合成。导入抑癌基因反义核酸技术

(antisensetechnology)：

①反义RNA；②反基因技术；③核酶RNA干扰（RNAinterference)4.基因干预（geneinterference）抑癌基因疗法抑癌基因：是正常细胞内正常存在的，能抑制细胞转化和肿瘤发生的一类基因群。

Rb基因，p53基因，MTS基因，nm23基因p53基因治疗研究：

（1）野生型p53基因的替代疗法（2）突变型p53基因的阻断疗法（3）与p53基因有关的新型肿瘤疫苗抑癌基因疗法抑癌基因：是正常细胞内正常存在的，能抑制细胞转化反义核酸反义RNA（antisenseRNA）：与mRNA互补的RNA，抑制mRNA的加工与翻译。核酶（ribozyme）：具有催化功能的RNA，其与相应mRNA结合后能发挥酶活性，将mRNA降解。反义脱氧寡核苷酸，ODN反义核酸反义RNA（antisenseRNA）：与mRNA反义RNA技术体外合成反义RNA，直接导入；将特异的反义基因通过特定的表达载体（质粒、病毒）导入细胞，转录出反义RNA发挥作用，避免了在给药途径中易被RNase降解的缺点。反义RNA技术体外合成反义RNA，直接导入；关键性问题1.专一性转移如何专一的作用于病变细胞，而不影响其他正常细胞。2.反义RNA进入靶细胞前的降解问题解决：特定受体介导的反义RNA转移关键性问题1.专一性转移受体介导的反义RNA转移

脱唾液酸糖蛋白（ASGP）受体介导的转移，通过化学物质作为中间连接物，将ASGP与多聚赖氨酸（PL）共价结合，得到ASGP-PL复合物，这种复合物可以携带RNA，再专一性地被肝细胞表面的ASGP受体所识别，并被吞噬到肝细胞内发挥作用。受体介导的反义RNA转移脱唾液酸糖蛋白（ASGP）受体介反义RNA应用前景1.

安全性高

不改变基因结构，最终在细胞内被降解。2.

设计和制备方便

体外转录获得。3.

具有剂量调节效应4.

能直接作用于一些RNA病毒反义RNA应用前景1.安全性高反基因技术脱氧寡核苷酸（oligodeoxyribonucleotide,

ODN），也被称为TFO

(triplehelix-formingoligo)通过TFO在DNA结合蛋白的识别位点处，与靶基因结合形成三螺旋，从而位点专一性地干扰DNA与反式作用因子的结合，抑制转录起始或转录延伸，达到“反基因”的目的。DNA水平阻止基因转录肽核酸（peptidenucleicacids，PNA，一种以多肽骨架取代糖-磷酸骨架的DNA类似物）反基因技术脱氧寡核苷酸（oligodeoxyribonucl基因治疗课件最新版核酶催化RNA切割和RNA剪接Recognitionsequences“hammerhead”ribozymes核酶催化RNA切割和RNA剪接Recognition1981年，Cetch和Alfman首次发现了一类具有特异性剪切RNA活性的RNA分子。1981年，Cetch和Alfman首次发现了一类具有特异性核酶具有稳定的空间结构，不易受到RNA酶的攻击。核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合并切割其他的mRNA，效率高于反义RNA。核酶的特点

核酶具有稳定的空间结构，不易受到RNA酶的攻击。核酶的特点RNA干扰技术概念：短的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使同源mRNA发生特异性的降解，从而阻断相应基因的表达。高度的序列专一性高效性易操作性RNA干扰技术概念：短的双链RNA(dsRNA)导入细胞miRNAMicroRNA（miRNA）是内源性的，是一种非编码的RNA；由miRNA基因表达出最初的pri-miRNA分子。靶标mRNA通常发生不完全结合，并且结合的位点是mRNA的非编码区的3’端；它不会降解靶标mRNA，而只是阻止mRNA的翻译。miRNA能够调节与生长发育有关的基因。在生物体中的表达具有时序性、保守性和组织特异性miRNAMicroRNA（miRNA）是内源性的，是一种非(二)间接策略

导入与致病基因无直接联系的治疗基因免疫基因治疗分子化疗特异性细胞杀伤(二)间接策略

导入与致病基因无直接联系的治疗基因免疫基1.免疫基因治疗(1)细胞因子基因治疗

IL-2、IL-4、IL-1、IL-6、IL-7、IL-12、

INF-γ、TNF-α、G-CSF、GM-CSF(2)免疫增强基因疗法

MHCI类抗原、共刺激分子(3)肿瘤DNA疫苗疗法癌胚抗原（CEA）制备的肿瘤DNA疫苗1.免疫基因治疗(1)细胞因子基因治疗TumourNecrosisFactorTumourNecrosisFactor2.分子化疗(1)

自杀基因疗法：TK基因、CD基因(2)化疗保护性基因治疗：MDR基因(3)

药物增敏基因治疗：钙调素基因

2.分子化疗(1)自杀基因疗法：TK基因、CD基因

(1)自杀基因疗法

自杀基因（suicidegene)，前体药物酶转化基因该基因表达产生的酶可催化无毒性的药物前体转变为细胞毒性物质，从而杀死肿瘤细胞；同时通过“旁观者效应”（bystandereffect）杀死邻近未导入该基因的分裂细胞而显著扩大杀伤效应。由于携带该基因的受体细胞本身也被杀死，所以这类基因被称为“自杀基因”。(1)自杀基因疗法自杀基因（suicidegene自杀基因单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因编码胸苷激酶（TK）催化丙氧鸟苷（ganciclovir,GCV）成为磷酸化的核苷酸类似物，阻断DNA的合成而使细胞死亡。大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（CD）基因将5’-氟胞嘧啶（5’-FC）转化为5’-氟尿嘧啶（5’-FU）而发挥细胞毒性作用。自杀基因单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因viralvector（HSV）tumourcellthymidinekinasegeneganciclovir

phosphateGanciclovir（GCV）tkviralvectortumourcellthyGanciclovirphosphateinhibitsDNApolymeraseCelldeath–IncludingbystandercellsGanciclovirphosphateCelldeat(2)化疗保护性基因治疗指将编码抗细胞毒性药物蛋白的基因导入人体细胞，以提高机体耐受肿瘤化疗药物的能力。如将多药抗性（multipledrugresistance,MDR）基因MDR-1导入骨髓造血干细胞，减少骨髓受抑制的程度，以加大化疗剂量，提高化疗效果。(2)化疗保护性基因治疗指将编码抗细胞毒性药物蛋白的基

(3)药物增敏基因治疗将外源基因插入肿瘤细胞后，改变肿瘤细胞对药物的敏感性。如将钙调素基因转入癌细胞，其表达产物作为细胞内信号转导系统的重要物质，明显增强肿瘤细胞对化疗药物的吸收量而相应减少了排出量，使癌细胞对化疗药物的敏感性明显提高。(3)药物增敏基因治疗将外源基因插入肿瘤细胞后，改变肿瘤3.特异性细胞杀伤指利用重组DNA技术将生物来源的细胞毒素基因与一些特异受体的配体基因融合，构建融合基因，导入高度表达该受体的肿瘤细胞，以特异性杀伤该肿瘤细胞。3.特异性细胞杀伤指利用重组DNA技术将生物来源的细胞毒素基特异性细胞杀伤如将绿脓杆菌外毒素（PE）或白喉毒素（DT）基因与TGFα基因组成融合基因TGFα-PE，或TGFα-DT。由于TGFα与表皮生长因子EGF结构类似，也能与表皮生长因子受体（EGFR）结合；故该融合基因可特异性进入并杀死高度表达EGFR的膀胱癌、肾癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤细胞。特异性细胞杀伤如将绿脓杆菌外毒素（PE）或白喉毒素（DT）基三、基因治疗的基本流程（一）外源基因的选择与制备（二）载体的选择与构建（三）靶细胞的选择（四）基因转移（五）基因转染细胞的筛选与鉴定（六）回输体内

三、基因治疗的基本流程（一）外源基因的选择与制备基因治疗的方式根据基因导入的方式分为两种：1.直接体内疗法（invivo）是指将目的基因直接导入体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。2.间接体内疗法（exvivo）是指在体外将目的基因导入靶细胞，经过筛选和增殖后将细胞回输给患者，使该基因在体内有效地表达相应产物，以达到治疗的目的。

基因治疗的方式根据基因导入的方式分为两种：基因治疗课件最新版基因治疗的种类生殖细胞基因治疗可遗传性伦理学问题

禁止应用人体体细胞基因治疗：研究重点基因治疗的种类生殖细胞基因治疗体细胞治疗的概念指应用人的自体、同种异体或异种（非人体）的体细胞；经体外操作后。回输（或植入）人体的治疗方法。体细胞治疗的概念指应用人的自体、同种异体或异种（非人体）的体（一）外源基因的选择与制备

外源基因目的基因：与致病基因相对应的有功能的正常基因与致病基因无关、有治疗作用的基因标记基因:新霉素磷酸转移酶（Neo）基因外源基因的获得

基因克隆人工合成PCR扩增（一）外源基因的选择与制备外源基因外源基因的选择原则体内少量表达就可显著改善症状；过高表达不会对机体造成危害；在抗病毒和病原体的基因治疗中，所选择的靶基因应在病毒和病原体的生活史中起重要的作用，并且该序列是特异的；肿瘤病人多有免疫缺陷，可选用免疫因子基因转入人体；可采用反义技术封闭细胞内活化的癌基因或向细胞内转入野生型抑癌基因，抑制肿瘤生长，所针对的癌基因或抑癌基因应与该肿瘤的发生和发展有明确的相关性。外源基因的选择原则体内少量表达就可显著改善症状；（二）载体的选择与构建

病毒载体：

逆转录病毒（RV)腺病毒（AV)腺相关病毒（AAV)单纯疱疹病毒（HSV)痘苗病毒（VV)非病毒载体：

脂质体法直接注射法受体介导基因转移DNA-磷酸钙共沉淀电穿孔（二）载体的选择与构建病毒载体：非病毒载体：逆转录病毒结构逆转录病毒结构逆转录病毒的基因组结构3’LTR5’LTRgagpolenv结构基因gag(groupantigen)

：编码核心蛋白和属特异性抗原pol(polymerase)

：编码逆转录酶env

(envelop)

：编码病毒外壳蛋白和包膜蛋白LTR（longterminalrepeat）序列含增强子、启动子、转录所需起始和终止信号逆转录病毒的基因组结构3’LTR5’LTRgag逆转录病毒的生活史逆转录病毒宿主细胞病毒RNAcDNA前病毒病毒RNA包装蛋白包装成完整的病毒颗粒出芽分泌子代病毒感染其他细胞整合逆转录病毒的生活史逆转录病毒宿主细胞病毒RNAcDNA前病病毒载体构建（1）去除病毒致病性结构的基因序列如逆转录病毒的gag、pol、env基因，从结构上保证病毒的安全性。同时产生的空白区以目的基因取而代之；（2）保留其基因的调控序列及包装序列等；（3）插入标记基因如Neo基因以对基因转染细胞的抗性筛选等。病毒载体构建（1）去除病毒致病性结构的基因序列如逆转录病毒的包装细胞指将缺失了包装信号及相关序列的缺陷型逆转录病毒（辅助病毒）导入哺乳细胞内而制备成的一种特殊的细胞系.这种细胞因携带有完整的病毒结构基因序列能够大量产生病毒包装蛋白，而辅助病毒自身缺乏包装信号（ψ序列）而不能包装,不产生有复制能力的野生型病毒颗粒。包装细胞指将缺失了包装信号及相关序列的缺陷型逆转录病毒（辅助假病毒颗粒当逆转录病毒载体转染进包装细胞后，转录出标记基因和目的基因的RNA，含有两端的LTR和包装信号，被包装细胞产生的病毒蛋白包装成病毒颗粒。因包装的RNA中不含病毒蛋白的编码序列，导致这种病毒只有一次感染能力，即在感染细胞后，不能产生新的病毒颗粒，称为假病毒颗粒。假病毒颗粒释放到包装细胞的培养液中，用于感染靶细胞，从而将其携带的治疗基因送入靶细胞。假病毒颗粒当逆转录病毒载体转染进包装细胞后，转录出标记基因和VectorDNAHelperDNAEngineeringaVirusintoaVectorwildtypevirusViralvectorreplicationproteinsstructuralproteinsPackagingTherapeuticgeneessentialviral

genesPackagingcellVectorDNAHelperDNAEngineerinYvectorVectoruncoatingTherapeuticmRNAandproteinEpisomalvectorIntegratedexpressionTargetcellGeneTransferBasedonKayetal2001YvectorVectoruncoatingTherape逆转录病毒载体的特点1.env编码的糖蛋白结合细胞膜上的特异性受体，基因转移效率更高；2.

结构基因gag、env、pol的缺失不影响其他部分的活性；3.

整合到靶细胞基因组，可长期表达；4.

包装好的假病毒颗粒分泌至包装细胞的培养上清中，易于分离制备。逆转录病毒载体的特点1.env编码的糖蛋白结合细胞膜上的特问题1.只能感染分裂期细胞,靶细胞DNA合成很活跃，因为病毒感染和整合作用均依赖靶细胞DNA的复制；2.

安全性问题随机整合：诱发插入突变，激活癌基因缺陷型逆转录病毒通过重组获得复制能力问题1.只能感染分裂期细胞,靶细胞DNA合成很活跃，因为病腺病毒载体1.基因组：双链无包膜DNA病毒，36kb2.通过受体介导内吞作用进入细胞，基因导入效率高。3.不整合宿主基因组，安全。4.宿主细胞范围广泛。5.可口服、喷雾吸入或气管内滴注。6.载体容量大。7.体外容易培养制备，病毒滴度较高。腺病毒载体1.基因组：双链无包膜DNA病毒，36kb基因治疗课件最新版常用的病毒载体及其基因转移的特点

逆转录病毒腺病毒腺相关病毒单纯疱疹病毒

基因组正链RNA线性dsDNA线性ssDNAdsDNA8～11kb36kb4.7kb152kb外源基因容量

<7kb7.5kb<3.5kb30kb重组病毒滴度中高较低高靶细胞状态分裂细胞，表面分裂细胞或分裂细胞或分裂细胞或须有特殊受体非分裂细胞非分裂细胞非分裂细胞基因转移效率高高高高基因整合随机整合不整合定点整合于不整合染色体19q外源基因表达状况短暂/稳定表达短暂表达稳定表达短暂/稳定表达安全性及其它相对较安全可能引起炎症无病原性可能出现毒性反应宿主范围广和免疫反应神经细胞嗜向性常用的病毒载体及其基因转移的特点(三)靶细胞的选择

生殖细胞:禁止体细胞：淋巴细胞、造血细胞、内皮细胞、肌肉细胞、肝细胞、成纤维细胞肿瘤细胞等(三)靶细胞的选择生殖细胞:禁止靶细胞的选择

可根据疾病的特点、目的基因及其转移的方式等因素来确定。选择的原则：

(1)便于从体内取出和回输；

(2)便于在体外培养与增殖；

(3)便于基因的高效转移；

(4)能够持续表达目的基因。靶细胞的选择可根据疾病的特点、目的基因及其转移的方式等因素(四)基因转移病毒法：主要通过携带有外源基因的病毒载体感染靶细胞来实现基因的转移。

非病毒法：物理方法——DNA直接注射、显微注射、电穿孔、微粒轰击及基因枪技术等；化学方法——脂质体融合法、磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖法等。受体介导的内吞作用

(四)基因转移病毒法：脂质体liposomes脂质体liposomes其基本原理是利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，然后与细胞一起温育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA转移到细胞内。优势：使用方便、成本低廉。缺陷：转染效率较低和转染基因表达时间短暂。基因治疗课件最新版(五)基因转染细胞的筛选与鉴定(五)基因转染细胞的筛选与鉴定(五)基因转染细胞的筛选与鉴定外源基因表达的鉴定：采用Northern印迹杂交：检测mRNA的表达测定其表达产物即蛋白质的含量等方法。

动物实验(五)基因转染细胞的筛选与鉴定外源基因表达的鉴定：(六)回输体内方式：静脉注射、肌注、皮下注射、滴鼻等基因修饰的淋巴细胞以静脉注射的方式回输到血液中；将皮肤成纤维细胞以细胞胶原悬液注射至患者皮下组织；采用自体骨髓移植的方法输入造血细胞；或以导管技术将血管内皮细胞定位输入血管等。(六)回输体内方式：第一军医大学分子生物学研究所四、基因治疗的应用与展望第一军医大学分子生物学研究所四、基因治疗的应用基因治疗的应用遗传病替补法，导入正常基因病毒性疾病阻断病毒基因在体内的转录和翻译肿瘤基因的补充和修复，免疫疗法，细胞毒基因疗法基因治疗的应用遗传病遗传病的基因治疗1）在DNA水平明确其发病原因及机制；2）隐性遗传的单基因遗传病；3）该基因的表达不需要精确调控；4)该基因能在一种便于临床操作的组织细胞中表达并发挥生理作用；5）该遗传病不经治疗将有严重后果。遗传病的基因治疗1）在DNA水平明确其发病原因及机制；遗传病基因治疗的临床研究1.腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症2.家族性高胆固醇血症（FH）3.囊性纤维变性（CF）4.粘多糖沉积症5.血友病B（凝血因子IX缺乏）遗传病基因治疗的临床研究1.腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症“先天性重症联合免疫缺陷综合征”(SCID)“先天性重症联合免疫缺陷综合征”(SCID)AshantiDeSilvawasthefirstpatienttobetreatedwithgenetherapyin1990.ShereceivedinfusionsofTcellsthathadbeentransducedwithageneforADA(anenzymethatshelacks)AshantiDeSilvawasthefirstADA缺陷病的分子机制腺苷脱氨酶（ADA）催化腺嘌呤核苷（A）和脱氧腺嘌呤核苷（dA）脱氨，生成次黄嘌呤核苷和脱氧次黄嘌呤核苷。ADA缺陷→脱氧腺嘌呤核苷酸代谢受阻→dATP↑

→抑制核糖核苷还原酶活性→阻止DNA复制和修复→导致细胞死亡，对淋巴细胞毒性最强。ADA缺陷病的分子机制腺苷脱氨酶（ADA）催化腺嘌呤核苷（A1）单个核细胞的分离：使用淋巴细胞分层液分离患儿血中单个核细胞；2）单个核细胞培养：以“CD3抗体+IL2”体外培养以刺激T细胞增殖，分化；3）逆转录病毒载体介导外源基因（治疗基因+标志基因）转染T细胞；4）将转染细胞回输给患儿体内。ADA基因治疗方案1）单个核细胞的分离：使用淋巴细胞分层液分离患儿血中单个核细肿瘤的基因治疗策略一、抑制和杀伤肿瘤细胞1.自杀基因疗法（tk、CD基因）2.抑制癌基因的表达（反义RNA、核酶、细胞内抗体）3.恢复抑癌基因的功能（p53、Rb基因）4.抗肿瘤血管形成肿瘤的基因治疗策略一、抑制和杀伤肿瘤细胞肿瘤的基因治疗策略二、肿瘤细胞的基因“修饰”1.导入细胞因子基因2.导入MHC基因和共刺激分子基因肿瘤的基因治疗策略二、肿瘤细胞的基因“修饰”三、调节和增强机体的免疫功能1.细胞因子基因导入免疫细胞2.基因修饰的树突状细胞3.分泌免疫毒素的T淋巴细胞4.肿瘤DNA疫苗肿瘤的基因治疗策略三、调节和增强机体的免疫功能肿瘤的基因治疗策略肿瘤基因治疗临床试验方案黑色素瘤83前列腺癌44乳腺癌32间质瘤3卵巢癌31头颈部癌症31胶质瘤28结肠癌25肺癌26胰腺癌3肾癌21膀胱癌2成神经细胞瘤7子宫颈癌6肿瘤基因治疗临床试验方案黑色素瘤83前列腺癌44乳腺癌32间病毒性疾病的基因治疗针对病毒:诱导对病毒RNA的降解抑制病毒与宿主细胞结合干扰病毒基因组的转录起始和调控抑制病毒基因组的复制和蛋白质合成RNA干扰技术病毒性疾病的基因治疗针对病毒:中国的基因治疗1991.12血友病B，凝血因子IX，逆转录病毒载体，导入患者自身皮肤成纤维细胞。恶性脑胶质瘤，TK基因非小细胞肺癌，逆转录病毒，IL-2中国的基因治疗1991.12血友病B，凝血因子IX，逆转基因治疗药物2003年10月16日，拥有自主知识产权的重组人p53腺病毒注射液(Gendicine)获得国家食品药品监督管理局批准的新药证书。这是世界上第一个获得正式批准的基因治疗药物。基因治疗药物2003年10月16日，拥有自主知识产权的重组人基因治疗存在的问题三个关键问题：

构建高效、靶向性基因转移系统发现切实有效的治疗基因外源基因表达的调控一个需要重视的问题：

外源基因的导入对机体带来的不利影响

基因治疗存在的问题三个关键问题：1999年“杰辛格”基因疗法失败.18岁的泽西·杰辛格患有鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)缺失症，接受基因疗法后意外死亡。1999年“杰辛格”基因疗法失败.基因治疗课件最新版基因治疗课件最新版基因治疗课件最新版基因治疗课件最新版基因治疗课件最新版现状及展望基因治疗现阶段仅仅是实验性地运用于经过其他治疗无效的“绝症”；酶及药物性的化学疗法，以及骨髓、器官移植仍然是当前治疗多种遗传病的最有效手段；癌症的治疗仍以手术切除及化疗为主。道路曲折，前途光明现状及展望基因治疗现阶段仅仅是实验性地运用于经过其他治疗无效本章小结基因治疗：指将外源基因转移至患者细胞内并有效适度表达，以达到治疗疾病的目的。基因治疗策略：(1)直接策略：基因矫正、基因置换、基因增补、基因干预；(2)间接策略：免疫基因治疗、分子化疗、特异性细胞杀伤等。本章小结基因治疗：本章小结基因治疗方式：直接体内疗法和间接体内疗法两种。基本流程：外源基因的选择与制备、表达载体的选择与构建、靶细胞的选择，基因转移，基因转染细胞的筛选与鉴定，回输体内。基因治疗在遗传性疾病、肿瘤、心血管疾病、感染性疾病以及神经系统疾病等的治疗中具有诱人的前景。本章小结基因治疗方式：思考题肿瘤的基因治疗包括哪些基本策略？以逆转录病毒载体进行exvivo基因治疗为例，试述其技术原理及基本过程。针对目前存在的问题，该怎样看待基因治疗的现状及发展前景？思考题肿瘤的基因治疗包括哪些基本策略？基因治疗课件最新版本文档支持任意编辑，下载使用，定会成功！本文档支持任意编辑，下载使用，定会成功！危敏副教授南方医科大学基因工程研究所基因治疗危敏副教授南方医科大学基因治疗药物治疗手术治疗放射治疗理疗传统治疗方法新的生物治疗：

基因治疗(genetherapy)药物治疗传统治疗方法新的生物治疗：基因治疗一、概念二、策略三、基本流程四、应用与展望基因治疗一、概念一、基因治疗的概念一、基因治疗的概念概念的发展经典概念：将具有正常功能的基因置换或增补患者体内的缺陷基因，从而达到治疗疾病的目的。广义概念：将某种遗传物质转移至患者细胞内，使其在体内有效表达，最终达到治疗疾病目的的方法，均称之为基因治疗。概念的发展经典概念：将具有正常功能的基因置换或增补患者体内的二、基因治疗的策略

(一)直接策略：针对致病基因(二)

间接策略：导入与致病基因无直接联系的治疗基因二、基因治疗的策略(一)直接策略：(一)直接策略基因矫正（genecorrection）基因置换（genereplacement）基因增补（geneaugmentation）又称为补偿性基因治疗4.

基因干预（geneinterference）又称为反义基因治疗(一)直接策略基因矫正（genecorrection）基因矫正（genecorrection）指将致病基因的突变碱基加以纠正，而保留正常部分。基因置换（genereplacement）指通过同源重组（基因打靶）技术，将正常基因定点整合到靶细胞基因组内，以原位替换致病基因。不涉及基因组整体改变的情况下对缺陷基因进行精确的原位修复，是最理想的治疗方式。基因矫正（genecorrection）基因打靶技术

指目的基因导入靶细胞后，通过目的基因与靶细胞内染色体上同源DNA序列间的交换，将目的基因定点整合到靶细胞基因组上某一确定位点的技术。基因打靶技术指目的基因导入靶细胞后，通过目的基因与3.

基因增补（geneaugmentation）

成熟的策略

是指不去除异常基因，将有功能的正常基因导入病变细胞或其它细胞后发生非定点整合，表达正常产物以补偿缺陷基因的功能，或使原有的功能得以加强。3.基因增补（geneaugmentation）4.基因干预（geneinterference）是采用特定的方法，导入外源基因选择性地阻断、干扰、抑制和封闭有害基因在DNA、RNA和蛋白质水平的表达及其生物合成。导入抑癌基因反义核酸技术

(antisensetechnology)：

①反义RNA；②反基因技术；③核酶RNA干扰（RNAinterference)4.基因干预（geneinterference）抑癌基因疗法抑癌基因：是正常细胞内正常存在的，能抑制细胞转化和肿瘤发生的一类基因群。

Rb基因，p53基因，MTS基因，nm23基因p53基因治疗研究：

（1）野生型p53基因的替代疗法（2）突变型p53基因的阻断疗法（3）与p53基因有关的新型肿瘤疫苗抑癌基因疗法抑癌基因：是正常细胞内正常存在的，能抑制细胞转化反义核酸反义RNA（antisenseRNA）：与mRNA互补的RNA，抑制mRNA的加工与翻译。核酶（ribozyme）：具有催化功能的RNA，其与相应mRNA结合后能发挥酶活性，将mRNA降解。反义脱氧寡核苷酸，ODN反义核酸反义RNA（antisenseRNA）：与mRNA反义RNA技术体外合成反义RNA，直接导入；将特异的反义基因通过特定的表达载体（质粒、病毒）导入细胞，转录出反义RNA发挥作用，避免了在给药途径中易被RNase降解的缺点。反义RNA技术体外合成反义RNA，直接导入；关键性问题1.专一性转移如何专一的作用于病变细胞，而不影响其他正常细胞。2.反义RNA进入靶细胞前的降解问题解决：特定受体介导的反义RNA转移关键性问题1.专一性转移受体介导的反义RNA转移

脱唾液酸糖蛋白（ASGP）受体介导的转移，通过化学物质作为中间连接物，将ASGP与多聚赖氨酸（PL）共价结合，得到ASGP-PL复合物，这种复合物可以携带RNA，再专一性地被肝细胞表面的ASGP受体所识别，并被吞噬到肝细胞内发挥作用。受体介导的反义RNA转移脱唾液酸糖蛋白（ASGP）受体介反义RNA应用前景1.

安全性高

不改变基因结构，最终在细胞内被降解。2.

设计和制备方便

体外转录获得。3.

具有剂量调节效应4.

能直接作用于一些RNA病毒反义RNA应用前景1.安全性高反基因技术脱氧寡核苷酸（oligodeoxyribonucleotide,

ODN），也被称为TFO

(triplehelix-formingoligo)通过TFO在DNA结合蛋白的识别位点处，与靶基因结合形成三螺旋，从而位点专一性地干扰DNA与反式作用因子的结合，抑制转录起始或转录延伸，达到“反基因”的目的。DNA水平阻止基因转录肽核酸（peptidenucleicacids，PNA，一种以多肽骨架取代糖-磷酸骨架的DNA类似物）反基因技术脱氧寡核苷酸（oligodeoxyribonucl基因治疗课件最新版核酶催化RNA切割和RNA剪接Recognitionsequences“hammerhead”ribozymes核酶催化RNA切割和RNA剪接Recognition1981年，Cetch和Alfman首次发现了一类具有特异性剪切RNA活性的RNA分子。1981年，Cetch和Alfman首次发现了一类具有特异性核酶具有稳定的空间结构，不易受到RNA酶的攻击。核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合并切割其他的mRNA，效率高于反义RNA。核酶的特点

核酶具有稳定的空间结构，不易受到RNA酶的攻击。核酶的特点RNA干扰技术概念：短的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使同源mRNA发生特异性的降解，从而阻断相应基因的表达。高度的序列专一性高效性易操作性RNA干扰技术概念：短的双链RNA(dsRNA)导入细胞miRNAMicroRNA（miRNA）是内源性的，是一种非编码的RNA；由miRNA基因表达出最初的pri-miRNA分子。靶标mRNA通常发生不完全结合，并且结合的位点是mRNA的非编码区的3’端；它不会降解靶标mRNA，而只是阻止mRNA的翻译。miRNA能够调节与生长发育有关的基因。在生物体中的表达具有时序性、保守性和组织特异性miRNAMicroRNA（miRNA）是内源性的，是一种非(二)间接策略

导入与致病基因无直接联系的治疗基因免疫基因治疗分子化疗特异性细胞杀伤(二)间接策略

导入与致病基因无直接联系的治疗基因免疫基1.免疫基因治疗(1)细胞因子基因治疗

IL-2、IL-4、IL-1、IL-6、IL-7、IL-12、

INF-γ、TNF-α、G-CSF、GM-CSF(2)免疫增强基因疗法

MHCI类抗原、共刺激分子(3)肿瘤DNA疫苗疗法癌胚抗原（CEA）制备的肿瘤DNA疫苗1.免疫基因治疗(1)细胞因子基因治疗TumourNecrosisFactorTumourNecrosisFactor2.分子化疗(1)

自杀基因疗法：TK基因、CD基因(2)化疗保护性基因治疗：MDR基因(3)

药物增敏基因治疗：钙调素基因

2.分子化疗(1)自杀基因疗法：TK基因、CD基因

(1)自杀基因疗法

自杀基因（suicidegene)，前体药物酶转化基因该基因表达产生的酶可催化无毒性的药物前体转变为细胞毒性物质，从而杀死肿瘤细胞；同时通过“旁观者效应”（bystandereffect）杀死邻近未导入该基因的分裂细胞而显著扩大杀伤效应。由于携带该基因的受体细胞本身也被杀死，所以这类基因被称为“自杀基因”。(1)自杀基因疗法自杀基因（suicidegene自杀基因单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因编码胸苷激酶（TK）催化丙氧鸟苷（ganciclovir,GCV）成为磷酸化的核苷酸类似物，阻断DNA的合成而使细胞死亡。大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（CD）基因将5’-氟胞嘧啶（5’-FC）转化为5’-氟尿嘧啶（5’-FU）而发挥细胞毒性作用。自杀基因单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因viralvector（HSV）tumourcellthymidinekinasegeneganciclovir

phosphateGanciclovir（GCV）tkviralvectortumourcellthyGanciclovirphosphateinhibitsDNApolymeraseCelldeath–IncludingbystandercellsGanciclovirphosphateCelldeat(2)化疗保护性基因治疗指将编码抗细胞毒性药物蛋白的基因导入人体细胞，以提高机体耐受肿瘤化疗药物的能力。如将多药抗性（multipledrugresistance,MDR）基因MDR-1导入骨髓造血干细胞，减少骨髓受抑制的程度，以加大化疗剂量，提高化疗效果。(2)化疗保护性基因治疗指将编码抗细胞毒性药物蛋白的基

(3)药物增敏基因治疗将外源基因插入肿瘤细胞后，改变肿瘤细胞对药物的敏感性。如将钙调素基因转入癌细胞，其表达产物作为细胞内信号转导系统的重要物质，明显增强肿瘤细胞对化疗药物的吸收量而相应减少了排出量，使癌细胞对化疗药物的敏感性明显提高。(3)药物增敏基因治疗将外源基因插入肿瘤细胞后，改变肿瘤3.特异性细胞杀伤指利用重组DNA技术将生物来源的细胞毒素基因与一些特异受体的配体基因融合，构建融合基因，导入高度表达该受体的肿瘤细胞，以特异性杀伤该肿瘤细胞。3.特异性细胞杀伤指利用重组DNA技术将生物来源的细胞毒素基特异性细胞杀伤如将绿脓杆菌外毒素（PE）或白喉毒素（DT）基因与TGFα基因组成融合基因TGFα-PE，或TGFα-DT。由于TGFα与表皮生长因子EGF结构类似，也能与表皮生长因子受体（EGFR）结合；故该融合基因可特异性进入并杀死高度表达EGFR的膀胱癌、肾癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤细胞。特异性细胞杀伤如将绿脓杆菌外毒素（PE）或白喉毒素（DT）基三、基因治疗的基本流程（一）外源基因的选择与制备（二）载体的选择与构建（三）靶细胞的选择（四）基因转移（五）基因转染细胞的筛选与鉴定（六）回输体内

三、基因治疗的基本流程（一）外源基因的选择与制备基因治疗的方式根据基因导入的方式分为两种：1.直接体内疗法（invivo）是指将目的基因直接导入体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。2.间接体内疗法（exvivo）是指在体外将目的基因导入靶细胞，经过筛选和增殖后将细胞回输给患者，使该基因在体内有效地表达相应产物，以达到治疗的目的。

基因治疗的方式根据基因导入的方式分为两种：基因治疗课件最新版基因治疗的种类生殖细胞基因治疗可遗传性伦理学问题

禁止应用人体体细胞基因治疗：研究重点基因治疗的种类生殖细胞基因治疗体细胞治疗的概念指应用人的自体、同种异体或异种（非人体）的体细胞；经体外操作后。回输（或植入）人体的治疗方法。体细胞治疗的概念指应用人的自体、同种异体或异种（非人体）的体（一）外源基因的选择与制备

外源基因目的基因：与致病基因相对应的有功能的正常基因与致病基因无关、有治疗作用的基因标记基因:新霉素磷酸转移酶（Neo）基因外源基因的获得

基因克隆人工合成PCR扩增（一）外源基因的选择与制备外源基因外源基因的选择原则体内少量表达就可显著改善症状；过高表达不会对机体造成危害；在抗病毒和病原体的基因治疗中，所选择的靶基因应在病毒和病原体的生活史中起重要的作用，并且该序列是特异的；肿瘤病人多有免疫缺陷，可选用免疫因子基因转入人体；可采用反义技术封闭细胞内活化的癌基因或向细胞内转入野生型抑癌基因，抑制肿瘤生长，所针对的癌基因或抑癌基因应与该肿瘤的发生和发展有明确的相关性。外源基因的选择原则体内少量表达就可显著改善症状；（二）载体的选择与构建

病毒载体：

逆转录病毒（RV)腺病毒（AV)腺相关病毒（AAV)单纯疱疹病毒（HSV)痘苗病毒（VV)非病毒载体：

脂质体法直接注射法受体介导基因转移DNA-磷酸钙共沉淀电穿孔（二）载体的选择与构建病毒载体：非病毒载体：逆转录病毒结构逆转录病毒结构逆转录病毒的基因组结构3’LTR5’LTRgagpolenv结构基因gag(groupantigen)

：编码核心蛋白和属特异性抗原pol(polymerase)

：编码逆转录酶env

(envelop)

：编码病毒外壳蛋白和包膜蛋白LTR（longterminalrepeat）序列含增强子、启动子、转录所需起始和终止信号逆转录病毒的基因组结构3’LTR5’LTRgag逆转录病毒的生活史逆转录病毒宿主细胞病毒RNAcDNA前病毒病毒RNA包装蛋白包装成完整的病毒颗粒出芽分泌子代病毒感染其他细胞整合逆转录病毒的生活史逆转录病毒宿主细胞病毒RNAcDNA前病病毒载体构建（1）去除病毒致病性结构的基因序列如逆转录病毒的gag、pol、env基因，从结构上保证病毒的安全性。同时产生的空白区以目的基因取而代之；（2）保留其基因的调控序列及包装序列等；（3）插入标记基因如Neo基因以对基因转染细胞的抗性筛选等。病毒载体构建（1）去除病毒致病性结构的基因序列如逆转录病毒的包装细胞指将缺失了包装信号及相关序列的缺陷型逆转录病毒（辅助病毒）导入哺乳细胞内而制备成的一种特殊的细胞系.这种细胞因携带有完整的病毒结构基因序列能够大量产生病毒包装蛋白，而辅助病毒自身缺乏包装信号（ψ序列）而不能包装,不产生有复制能力的野生型病毒颗粒。包装细胞指将缺失了包装信号及相关序列的缺陷型逆转录病毒（辅助假病毒颗粒当逆转录病毒载体转染进包装细胞后，转录出标记基因和目的基因的RNA，含有两端的LTR和包装信号，被包装细胞产生的病毒蛋白包装成病毒颗粒。因包装的RNA中不含病毒蛋白的编码序列，导致这种病毒只有一次感染能力，即在感染细胞后，不能产生新的病毒颗粒，称为假病毒颗粒。假病毒颗粒释放到包装细胞的培养液中，用于感染靶细胞，从而将其携带的治疗基因送入靶细胞。假病毒颗粒当逆转录病毒载体转染进包装细胞后，转录出标记基因和VectorDNAHelperDNAEngineeringaVirusintoaVectorwildtypevirusViralvectorreplicationproteinsstructuralproteinsPackagingTherapeuticgeneessentialviral

genesPackagingcellVectorDNAHelperDNAEngineerinYvectorVectoruncoatingTherapeuticmRNAandproteinEpisomalvectorIntegratedexpressionTargetcellGeneTransferBasedonKayetal2001YvectorVectoruncoatingTherape逆转录病毒载体的特点1.env编码的糖蛋白结合细胞膜上的特异性受体，基因转移效率更高；2.

结构基因gag、env、pol的缺失不影响其他部分的活性；3.

整合到靶细胞基因组，可长期表达；4.

包装好的假病毒颗粒分泌至包装细胞的培养上清中，易于分离制备。逆转录病毒载体的特点1.env编码的糖蛋白结合细胞膜上的特问题1.只能感染分裂期细胞,靶细胞DNA合成很活跃，因为病毒感染和整合作用均依赖靶细胞DNA的复制；2.

安全性问题随机整合：诱发插入突变，激活癌基因缺陷型逆转录病毒通过重组获得复制能力问题1.只能感染分裂期细胞,靶细胞DNA合成很活跃，因为病腺病毒载体1.基因组：双链无包膜DNA病毒，36kb2.通过受体介导内吞作用进入细胞，基因导入效率高。3.不整合宿主基因组，安全。4.宿主细胞范围广泛。5.可口服、喷雾吸入或气管内滴注。6.载体容量大。7.体外容易培养制备，病毒滴度较高。腺病毒载体1.基因组：双链无包膜DNA病毒，36kb基因治疗课件最新版常用的病毒载体及其基因转移的特点

逆转录病毒腺病毒腺相关病毒单纯疱疹病毒

基因组正链RNA线性dsDNA线性ssDNAdsDNA8～11kb36kb4.7kb152kb外源基因容量

<7kb7.5kb<3.5kb30kb重组病毒滴度中高较低高靶细胞状态分裂细胞，表面分裂细胞或分裂细胞或分裂细胞或须有特殊受体非分裂细胞非分裂细胞非分裂细胞基因转移效率高高高高基因整合随机整合不整合定点整合于不整合染色体19q外源基因表达状况短暂/稳定表达短暂表达稳定表达短暂/稳定表达安全性及其它相对较安全可能引起炎症无病原性可能出现毒性反应宿主范围广和免疫反应神经细胞嗜向性常用的病毒载体及其基因转移的特点(三)靶细胞的选择

生殖细胞:禁止体细胞：淋巴细胞、造血细胞、内皮细胞、肌肉细胞、肝细胞、成纤维细胞肿瘤细胞等(三)靶细胞的选择生殖细胞:禁止靶细胞的选择

可根据疾病的特点、目的基因及其转移的方式等因素来确定。选择的原则：

(1)便于从体内取出和回输；

(2)便于在体外培养与增殖；

(3)便于基因的高效转移；

(4)能够持续表达目的基因。靶细胞的选择可根据疾病的特点、目的基因及其转移的方式等因素(四)基因转移病毒法：主要通过携带有外源基因的病毒载体感染靶细胞来实现基因的转移。

非病毒法：物理方法——DNA直接注射、显微注射、电穿孔、微粒轰击及基因枪技术等；化学方法——脂质体融合法、磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖法等。受体介导的内吞作用

(四)基因转移病毒法：脂质体liposomes脂质体liposomes其基本原理是利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，然后与细胞一起温育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA转移到细胞内。优势：使用方便、成本低廉。缺陷：转染效率较低和转染基因表达时间短暂。基因治疗课件最新版(五)基因转染细胞的筛选与鉴定(五)基因转染细胞的筛选与鉴定(五)基因转染细胞的筛选与鉴定外源基因表达的鉴定：采用Northern印迹杂交：检测mRNA的表达测定其表达产物即蛋白质的含量等方法。

动物实验(五)基因转染细胞的筛选与鉴定外源基因表达的鉴定：(六)回输体内方式：静脉注射、肌注、皮下注射、滴鼻等基因修饰的淋巴细胞以静脉注射的方式回输到血液中；将皮肤成纤维细胞以细胞胶原悬液注射至患者皮下组织；采用自体骨髓移植的方法输入造血细胞；或以导管技术将血管内皮细胞定位输入血管等。(六)回输体内方式：第一军医大学分子生物学研究所四、基因治疗的应用与展望第一军医大学分子生物学研究所四、基因治疗的应用基因治疗的应用遗传病替补法，导入正常基因病毒性疾病阻断病毒基因在体内的转录和翻译肿瘤基因的补充和修复，免疫疗法，细胞毒基因疗法基因治疗的应用遗传病遗传病的基因治疗1）在DNA水平明确其发病原因及机制；2）隐性遗传的单基因遗传病；3）该基因的表达不需要精确调控；4)该基因能在一种便于临床操作的组织细胞中表达并发挥生理作用；5）该遗传病不经治疗将有严重后果