第二章 生物制药技术与单元操作

2生物制药技术与单元操作2.1基因工程技术基因工程技术，又称DNA重组技术。通过基因工程技术操作，可以将外源DNA通过载体引入其它物种的细胞，赋予宿主细胞新的遗传特性或产生该宿主原来并不产生的新代谢物，并能遗传该特性。基因工程的原理是选择合适的外源目标DNA，然后通过体外操作将其整合到载体上，通过载体转入宿主细胞，并成功地在宿主细胞内稳定遗传和高效表达。1966年，发现了DNA连接酶。1970年Smith和Wilcox在流感嗜血杆菌中分离并纯化了限制性内切酶HindШ，使DNA分子的切割成为可能。1979年，Bltimore和Temin领导的两个研究小组分别在各自的工作中发现了逆转录酶。基因工程技术上三个重要成果1.基因工程的工具酶1972年，美国斯坦福大学博格（Berg）研究小组利用限制性内切酶EcoRI和T4DNA连接酶成功地进行了首例体外基因重组实验。2.基因工程载体为了使DNA片段能在宿主细胞中得以扩增，须将其接到一个特定能够进行自我复制的载体分子上。Lederberg开始从事细菌性因子（F）因子的研究。20世纪50到60年代年代，相继发现其他质粒，如抗药性基因（R因子）和大肠杆菌因子（Col）。这些工作为基因工程载体系统的建立打下基础。3.基因的体外重组技术1973年，科恩（Cohen）等人用EcoRI内切酶处理大肠杆菌的抗四环素和抗青霉素及磺胺的质粒，并连接成一个新的重组质粒。将这种工程化的质粒转入到大肠杆菌中，在含有四环素和青霉素的平板中筛选到了重组菌落。同年，加利福尼亚的博耶（Boyer）也进行了类似的实验。重组子转化的成功标志着基因工程的诞生。

基因工程（geneticengineering）是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，按照人类的需要进行设计，然后按设计方案创建出具有某种新的性状的生物新品系，并能使之稳定地遗传给后代。三、基因工程的研究内容2.1.1基因工程的操作程序1.克隆与克隆化克隆指同一副本或拷贝集合。从众多不同的分子群体中分离的某一感兴趣分子，经扩增产生很多相同分子集合，即为分子克隆。

2.DNA克隆在体外外来遗传物质与载体DNA结合成具自我复制的DNA分子，通过转化或转染宿主细胞、筛选出转化子细胞，再扩增提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆又称重组DNA。3.目的基因有时应用重组DNA技术的分离、获得某一感兴趣的基因或DNA序列，有时是为获得感兴趣基因的表达产物－蛋白质。一、基因工程的相关概念基因工程的基本操作程序应包括：目的基因的获取；目的基因与载体DNA体外重组；重组DNA分子导入受体细胞；筛选并鉴定无性繁殖含重组分子的受体细胞（转化子）；外源基因的表达。二、基因工程的基本操作程序4.基因载体也称克隆载体。这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。可充当克隆载体的DNA分子有质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA。1．直接从染色体DNA中分离：仅适用于原核生物基因的分离，较少采用2．人工合成根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。3.从mRNA合成cDNA采用一定的方法钓取特定基因的mRNA，再通过逆转录酶催化合成其互补DNA（cDNA）4．从基因文库中筛选5．利用PCR合成＊（一）、目的基因的获取基因组文库以生物体的RNA序列为模板，经反转录形成cDNA分子，再予以克隆。由于用以克隆的cDNA分子通常只有几个kb大小，所以很适合用质粒作载体。构建cDNA文库的程序：（1）制备含有polyA的RNA；（2）cDNA的合成；（3）cDNA与载体的连接；（4）转化。cDNA与载体分子形成重组分子后，转入受体菌株（如大肠杆菌），当不同的重组分子含有不同的基因时，整个转化子含有来自mRNA群体的各种cDNA基因，这个转化子群体构成了该mRNA全部遗传信息的cDNA基因文库。2.cDNA文库PCR技术基本步骤DNA的复制ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’变性退火链延伸热变性ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶引物引物变性

退火链延伸ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶变性退火

链延伸表琼脂糖浓度与DNA分离范围

核酸的电泳分离技术琼脂糖凝胶电泳的操作过程

荧光染料EB染色的原理EB：即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭溴盐(EthidiumBromide)。EB是一种扁平分子，它可以嵌入核酸双链配对碱基或碱基对之间，在紫外线激发下，发出红橙色荧光。激发的荧光的能量来源于两个方面：一是核酸吸收254nm的紫外线后将能量传递给EB，二是EB本身吸收302nm和360nm的紫外线的能量。这两方面的能量最终激发EB发射波长为590nm的可见光（红橙区）。2.1.2基因克隆的酶学基础限制性核酸内切酶(restrictionednonuclease)1.限制性核酸内切酶的概念是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。

2006年2月共发现3773种限制性内切酶，I、II、III型各有68、3692、10种，甲基化指导的3种,商品化的609种,II型中共有223种特异性。2.限制性核酸内切酶的命名原则1973年H.O.Smith和D.Nathams首次提出命名原则，1980年Roberts在此基础上进行了系统分类①限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名(genus);第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名(species)。②第四个字母代表宿主菌的株或型(strain)。③若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。限制性核酸内切酶的命名原则：属名

种名

株名Haemophilus

influenzae

d

流感嗜血杆菌d株

HindⅡ

HindⅢ同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶3.限制性核酸内切酶的分类据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三类。主要特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制修饰蛋白结构辅助因子识别序列切割位点多功能异源三聚体ATPMg2+SAM距识别序列1kb处随机性切割单功能同源二聚体Mg2+

4-6bp回文序列识别序列内或附近特异切割双功能异源二聚体ATPMg2+距识别序列下游24-26bp处随机性切割4.Ⅱ限制性核酸内切酶的功能Ⅱ限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序，它以核酸内切方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5′端为P，3′端为OH，识别序列一般为4～6个碱基对，通常是反转录重复顺序，具有180°的旋转对称性即回文结构。Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口。

Ⅱ型核酸内切酶的基本特征在DNA分子双链的特异性识别序列部位切割。2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的。形成的DNA片段具有互补的单链延伸末端。5.II型限制性核酸内切酶酶切反应操作◆大部分II型限制性核酸内切酶需要相似反应条件：Tris-HCl50mmol/LpH7.5MgCl210mmol/LNaCl0-100mmol/LDTT1mmol/LVolume20-100μL

Temperature37℃Time1-1.5h◆1个单位限制性核酸内切酶：在建议使用的缓冲液及温度下，在20μL反应液中反应1h，使1μg标准DNA完全消化所需的酶量。6.Ⅱ限制性核酸内切酶的主要用途①在特异位点上切割DNA，产生特异的限制性酶片段。②建立DNA分子的限制酶图谱。③构建基因文库。④用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组。⑤改建质粒。7.Ⅱ限制性核酸内切酶的星活性(staractivity)在极端非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能切割与特异识别序列相似的序列,降低酶切反应的特异性,这种改变的特殊性称为限制性核酸内切酶的星活性。产生Star活性后，不但可以切断特异性的识别位点，还可以切断非特异性的位点。产生Star活性的结果是酶切条带增多。

星活性产生的原因如下：①反应体系中甘油的浓度大于5%。②酶用量过大，大于100U/微克DNA。③低离子强度，小于25mmol/L。④高pH，大于8.0。⑤含有机剂，如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙 酰胺等。⑥Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二价 离子的存在。常发生星活性的内切酶有：EcoRI、HindⅢ、KpnI、PstI、SalI、HinfI等。

8.影响限制性核酸内切酶活性的因素①DNA样品的纯度

DNA样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等,都有可能抑制酶活性。

可采用以下方法，提高酶活性：加大酶的用量，1μgDNA用10U酶加大反应总体积延长反应时间②DNA样品的甲基化程度大肠杆菌中的dam甲基化酶在5′GATC3′序列中的腺嘌呤引入甲基，受其影响的酶有BclIMbol等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影响。大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5′CCAGG3′或5′CCTGG3′序列中的胞嘧啶引入甲基，受其影响的酶有EcoRII等，但BglI、KpnI不受影响。采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA，可防止DNA的甲基化。③酶切反应的温度多数标准反应温度是37℃，如SmaI为25℃或30℃，SfiI为50℃。反应温度过度或过低都会影响酶活性，甚至导致酶失活。④DNA分子结构

某些酶切割超螺旋质粒DNA时，酶量比切割线性DNA时高出多倍，可高达20倍。

⑤核酸内切酶的缓冲液

高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的“星活性”现象。9.Ⅱ限制性核酸内切酶操作的注意事项①商品化的限制性核酸内切酶均为浓缩液，每次操作时应使用新的吸头去取酶，加入酶的体积应不超过总体积的10%，否则酶液中的甘油浓度超过5%时将会抑制酶的活性。②整个操作应在0℃进行，即在冰浴中进行，而且是在加入其它试剂之后，最后加入酶。③当切割大量DNA时，通常采用延长反应时间，减少酶的用量。④当DNA需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液，若没有通用缓冲液时，只有用1种酶切完后，纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应。

其它工具酶核酸酶ＤＮＡ连接酶＊ＤＮＡ聚合酶＊末端脱氧核苷酸转移酶脱氧核糖核酸酶Ⅰ碱性磷酸酶＊

DNA连接酶(DNAlig