分子生物学 05-分子生物学研究法

分子生物学研究法一.重组DNA技术概论二.常见的DNA操作技术三.基因克隆技术(狭义)四.基因表达研究技术五.基因芯片及数据分析六.蛋白质组学及其研究技术一.重组DNA技术概论二.常见的DNA操作技术2.1琼脂糖凝胶电泳2.2SDS电泳2.3PCR技术2.4测序技术2.5杂交技术2.6ELISA技术2.7细菌转化2.8cDNA文库2.9SNP技术及应用2.10基因打靶琼脂糖凝胶电泳1、原理：2、用途：3、技术要点琼脂糖凝胶电泳的原理

1.DNA电泳迁移：电荷效应＋分子筛效益（1）DNA带负电，电场中，向正极移动；（2）决定移动速度三因素：DNA大小，电荷数，构型；

(3)线性DNA分子移动速度与其分子质量的对数成反比；（分子量越大，跑得越慢）

2、检测原理：（1）溴化乙锭（EB）可插入双链DNA分子中，在紫外光照射下，发射荧光。琼脂糖凝胶电泳用途1.DNA分子量测定（距离－>分子量）2.基因，克隆的鉴定（通过1完成）3、不同长度的基因片断的分离4、DNA浓度的测定

（荧光的强度与DNA含量成正比）*也可用于蛋白的分离鉴定加标准分子量DNAMarker,测定分子量加标准浓度的DNA，测定浓度琼脂糖凝胶电泳技术要点1.不同浓度凝胶分辨DNA片段能力不一样(p33)(1)低:不利于小片段的分辨(扩散)(2)高:不利于大片段的分辨(迁移不动)(3)一般选1.0%2.凝胶要用缓冲液配(TBE或TAE)3.EB强致癌，带手套操作；4.agarose(琼脂糖）－－－电泳

agar(含琼脂糖和琼脂胶）－－－平板培养基SDS电泳1、原理2、用途3、技术要点SDS电泳原理1.SDS(带负电)和还原剂破坏蛋白的高级结构,同时SDS与蛋白定量结合,消除蛋白之间的电荷差异,使得蛋白的迁移率主要依赖分子量(分子小跑得快).2.不连续电泳:上层为浓缩胶,可将样品压缩到同一起跑线,下层为分离胶;可获得更高的分辨率.3.考马斯亮蓝进行染色.SDS电泳用途1.蛋白分子量的测定2.蛋白浓度的测定3.蛋白的鉴定(通过1来实现)SDS技术要点1.浓缩胶一般用5%,

分离胶:次高分子(10万-20万)用7%,

低分子(1.4万－10万）用12％2、PAGE配制时带手套，（Acr-Bis液体有积累性神经毒，聚合后无毒)3.SDS－PAGE测定的是单体蛋白分子量；（多亚基不行）4、SDS－PAGE不适于：（1）电荷异常蛋白：组蛋白（＋电多）（2）构象异常的蛋白（3）带有较大辅基的蛋白－－糖蛋白，脂蛋白。PCR技术1、原理2、应用3、技术要点PCR技术原理循环过程(32次左右）1.解链：94℃,30s2.引物结合:？

℃，30s3.延伸：72℃，？Min

特点1.引物两条，以2n指数扩增（前20-25次），后面扩增效率降低，30次以后，基本进入平台期。2.引物结合温度？

℃一般为50-55℃，需要调整；3.延伸时间？Min需要调整，一般1kb/min.PCR技术应用1.基因检测；2.基因的制备（包括基因的修饰）PCR技术操作要点1.灵敏度高，防止污染，出现假阳性(带手套，设立阴性，阳性对照）；2.需要摸索结合温度，提高扩增的特异性。杂交技术1.Southernblot检测DNA2.Northernblot检测RNA3.Westernblot检测蛋白Southernblot,Northernblot和Westernblot比较名称检测对象探针检测原理处理过程用途SouthernblotDNA标记单链核酸核酸复性中碱基配对专一性琼脂糖电泳后转膜基因检测（拷贝数）NorthernblotRNA标记单链核酸核酸复性中碱基配对专一性变性琼脂糖电泳后转膜基因表达的检测（表达量）Westernblot蛋白抗体抗原－抗体特异性结合SDS后转膜基因表达产物――蛋白的检测ELISA原理和用途类似于Westernblot,但在酶标板中操作，无需SDS转膜，操作简单，可批量检测，并可半定量测定。SouthernblotNorthernblotWesternblot双脱氧法测序

(Dudeoxysequenceanalyses)双脱氧法又称末端终止法，用于单链测序1.原理：

Atkinson发现用DNApol合成DNA时如在反应物中加入一定量的2`,3`ddTTP时，因ddT

的3`碳原子不含－OH,故DNA不能延伸。1982年Sanger利用此原理建立了双脱氧测序法。原理和加减法相似，但不再是加一种dNTP或减一种dNTP,而是加入某一种双脱氧核苷，来终止聚合反应。用此法测得G4含5577bp.2.1细菌转化通常情况下，外源基因无法进入细菌细胞内；当用电击法，或CaCl2，或RuCl等方法处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源基因进入的感受态细胞。感受态细胞的活性较低，处理需温柔。2.2PCR(聚合酶链式反应)技术PCR的基本原理变性、复性、半保留复制

PCR三步曲变性90～97℃退火45～55℃延伸72℃PCR2.3cDNA文库cDNA:

(1)将mRNA反转录为双链DNA.

(2)特点:

A.稳定;

B.无内含子.二.cDNA文库:

(1)

代表了生物体某一器官或者组织mRNA中所含的全部或绝大部分遗传信息.(2)特点:

A.不同的生物,同一生物不同组织,同一组织不同发育时间或不同生理状态下,cDNA文库不同;B.建好的cDNA文库的具体的信息未知,仅提供吊取相关目的基因的材料.C.每个克隆不一定是全长基因cDNA文库建库过程1.高质量mRNA的制备;2.反转录生成cDNA3.与载体分子连接(噬菌体文库)4.转染(噬菌体的包装)说明:引物oligodT,随机引物R6(得到全长cDNA)两端可加上酶切接头,便于克隆到载体上.合成时,原料用甲基化的dCTP.防止酶切时损伤内部序列.转化效率要高,防止少量表达的mRNA未得到克隆.2.4SNP技术及应用Singlenucleotidepolymorphism单核苷酸多态性(标记)是指同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个碱基的变化，主要表现为基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性。用途:(1)遗传的分子标记物种鉴定

(2)生物功能异常的基因标记疾病的检测;SinglenucleotidepolymorphismSNP的特征SNP是人类可遗传的变异中最常出现的一种，占所有已知多态性的90%以上，在人类基因组中广泛存在，大约平均1000个碱基对就会出现一个SNP，估计整个人类基因组30亿碱基中至少有300万个SNP。

SNP大都表现为二等位基因（bialletic)多态性,即在该位置只存在两种不同的碱基。SNP作为一种碱基的替换，大多数为转换（C—T，G—A），也可能是颠换。转换的发生率总是明显高于其它几种变异，而且在CG序列上出现最为频繁，多是发生C—T的转换，原因是CG中的C是甲基化的，它能自发的脱氨基而替换为胸腺嘧啶。SNP的检测方法单链构象多态性(single-strandconformationalpolymorphism,SSCP)

原理：单链DNA的折叠结构是由单核苷酸序列决定的，当某一个碱基发生突变时，便会直接影响该链的构象，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移率会发生改变。变性梯度凝胶电泳（denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)

原理:当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性温度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳迁移率下降，DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度而被分离。荧光共振能量传递

(fluorescentresonanceenergytransfer,FRET)

供者受者

探针5‘3‘Taqman法分子信标(molecularbeacon)法

高效液相色谱ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ质谱分析法DNA芯片技术（DNAchip）

SNP数据库美国国立生物技术信息中心/snp德国的HGBAS网站

http://www.hgbas.cgr.ki.sei日本JST的数据库

http://snp.ims.u-tolkyo.ac.jp2.5基因打靶(genetargeting)通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，在生物活体内研究该基因的功能。(反向遗传学)基因敲除(geneknockout)：定向敲除基因敲入(geneknockin)：定向替代基因打靶的必备条件胚胎干细胞(ES细胞)能在体外培养，保留发育的全能性打靶载体Neo（新霉素）阳性筛选标志HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒(herpessimplexvirus)胸腺嘧啶激酶(thymidinekinase)基因敲除的基本程序打靶载体的构建打靶载体导入ES细胞：重组置换基因敲除ES细胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宫中嵌合体的杂交育种基因敲除Knockout1.完全基因敲除可能会致死.2.条件型基因敲除Cre/LoxP,FLP/FRT基因敲除的缺点能将基因与表型(生物功能)联系起来,但不能提供具体的作用机制;对多基因决定的表型无法将其联系全部找出;操作复杂,成本高.三.基因克隆技术(狭义)

获取目的基因的技术1.RACE技术2.cDNA差示显示法3.基因大规模克隆技术4.酵母双杂交法5.酵母单杂交系统6.基因的图位克隆法3.1RACE技术RapidamplificationofcDNAends已知基因一端序列,快速获取另一端序列.5’RACE(获取5’序列)3’RACE(获取3’序列)需要合成引物接头(单链DNA),用RNAligase将基因(RNA)与引物(DNA)连接.5’RACE3’RACE(非mRNA扩增)合成两条互补的引物,序列任意.及一条序列特异的引物互补引物中一条5’标记Pi,通过RNAligase将其与RNA连接.3.2cDNA差示显示法(cDNA-RDA)仅知道生理功能,性状,对基因序列一无所知.获得该相关基因的方法.原理:A.样本(sample)与对照(control)mRNAs被转录成cDNA,酶切加可PCR扩增接头,扩增后除去接头,只有样本被加上新接头(可PCR扩增).B.样本(ss)与过量对照(cc)杂交后,PCR扩增.sc被线形扩增;ss被指数扩增;CC不被扩增.3.3基因大规模克隆技术(Gateway克隆技术)1.不需要酶切,连接;2.利用TOPO反应,将PCR产物克隆到Entry载体;再通过LR反应,将基因定点,定向重组到表达载体.3.上游引物5’端需要引入CACC序列.3.4酵母双杂交法

（蛋白－蛋白相互作用）1.筛选与已知蛋白相互作用的蛋白基因2.真核生物的转录激活子基本结构一般有2个功能域（functionaldomain）DNA结合域（DNA-bindingdomain）－－DBD转录激活域（transcription-activatingdomain）--AD(许多激活子还有二聚体化域,有的还有受体结合域)“猎物”为一个库；２．将不同的“诱饵”克隆后，捕获不同的“猎物”３.5酵母单杂交

（蛋白核酸相互作用）用于鉴定与特定顺式作用元件（DNA序列）作用的转录调控因子的DNA结合域．或反之．３.6基因的图位克隆法

目的：克隆具有某种表型的未知基因的方法．原理：略四.基因表达研究技术１.基因表达系列分析技术（SAGE)2.RNA选择性剪切机制3.原位杂交技术４.定点突变技术５．RNAi技术4.１.基因表达系列分析技术（SAGE)

以测序为基础的定量分析全基因组表达模式的技术，能够直接读出任何一种类型细胞或组织的基因表达信息；理