甲酸乙酯对米象乙酰胆碱酯酶活性的影响

甲酸乙酯对米象乙酰胆碱酯酶活性的影响

粮食储备是合理利用粮食资源的重要手段之一。粮食在储存过程中容易受到有害药物的损害，导致粮食质量和数量的巨大损失。药剂熏蒸法是目前最为有效和经济的防治手段,熏蒸剂溴甲烷即将被淘汰、磷化氢抗性问题也日益严重,使得现在可选择的药剂品种越来越少,对粮食的安全储藏提出了严峻的挑战。甲酸乙酯(ethylformate)是一种对环境友好的新型绿色熏蒸剂,在常温下为无色液体,沸点为54.1℃,2002年甲酸乙酯作为处理干果的熏蒸剂在澳大利亚登记注册。近年来,澳大利亚联邦科学与工业研究组织(CSIRO)的科学家们经研究发现,甲酸乙酯作为粮食熏蒸剂具有以下优点:①杀虫迅速,一般在2d内就能发挥很好的杀虫活性;②熏蒸后植物种子的品质与发芽率不受影响;③甲酸乙酯会很快降解至自然水平,不会在储藏物中残留。因此,被广泛认为是一种很有潜力的粮食熏蒸剂。甲酸乙酯与CO2组成的液态混合熏蒸剂(VAPORMATETM)也已经在澳大利亚注册成功,关于甲酸乙酯应用的其他剂型正在开发期间。米象[Sitophilusoryzae(Linnaeus)]隶属鞘翅目(Coleoptera)象甲科(Curculionidae),是一种世界性的储粮害虫,严重危害各种谷物及种子、谷物加工品、豆类、油料、干果和药材等。本文研究了甲酸乙酯亚致死剂量对米象体内乙酰胆碱酯酶和羧酸酯酶的影响,以期有助于阐明该药剂的毒理机制和主要靶标。1材料和方法1.1米象成虫的人工养殖供试昆虫米象由国家粮食储备局成都粮食科学研究所提供,并在西南农业大学重庆市昆虫学及害虫控制工程重点实验室养虫室内人工饲养。将米象成虫接种于经Co60γ射线消毒过的小麦中,产卵7d后将成虫筛去,后代在温度为(30±1)℃,相对湿度为(75±5)%,24h黑暗的条件下继续培养。以羽化后7～14d的健康成虫作为试虫。1.2合成试剂及试剂甲酸乙酯(含量>98%)、α-萘酚(中国医药集团上海化学试剂公司生产);乙酸-α-萘酯(α-NA)(中国上海青浦合成试剂厂);毒扁豆碱(Sigma公司);固蓝B盐、碘化硫代乙酰胆碱(ATChI)、双(4-硝基-3-羧基苯)二硫化物(DTNB)(Fluka公司);十二烷基硫酸钠(SDS)、考马斯亮蓝G-250(AMRESCO分装)。以上试剂均为分析纯。UV-8500型紫外可见分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)。1.3广口瓶生物培养法采用广口瓶密闭熏蒸法。先将米象成虫放于容量为1000mL的广口瓶中,再将定量的甲酸乙酯滴在熏蒸盒(d=2cm,h=1cm)底部的滤纸上,然后迅速用尼龙纱布将盒子包好,置于广口瓶内,盖上瓶盖,并用保鲜膜将瓶口密封。将广口瓶置于事先设定好温度的培养箱内,全黑暗条件下进行熏蒸,24h药剂浓度设定24、26、28、30、32、34μL/L6个梯度,48h设定浓度梯度为20、22、24、26、28、30、32μL/L,每个处理供试成虫50头,3次重复,并设空白对照,在散气24h后检查记录成虫死亡数量。采用IRM害虫抗药性管理软件进行回归分析,用几率值法求出毒力回归线和LC50。1.4乙酰胆碱酯酶ache活性测定1.4.1不同药剂对ache酶活力的影响参照Ellman的方法。将米象成虫置于1000mL的广口瓶中,按照10、15、20μL/L的浓度加入甲酸乙酯,放置在25℃全黑暗的温箱中,在熏蒸4、8、16h和24h后散气,分别取存活的成虫10头,加入预冷的pH8.0、0.1mol/L的磷酸缓冲液1.5mL,于冰水浴中匀浆,匀浆液在4℃、10000g条件下离心20min,取上清液冰浴待测。用碘化硫代乙酰胆碱(ATChI)(1.5mmol/L)作底物,经AChE水解后生成硫代胆碱和乙酸,与显色剂DTNB(1.0mmol/L)生成黄色物质,以毒扁豆碱(1×10-4mol/L)终止反应,在412nm处测其OD值,每处理重复3次,并测定酶液中蛋白质含量。根据消光系数[e=1.36×10-4(mol/L)-1cm-1]将OD值换算成AChE的比活力(nmol/mg·min)。以酶活抑制率表示药剂对酶活力的影响,酶活抑制率=(对照组酶活力-处理组酶活力)/对照组酶活力×100%。Km值测定的反应总体积3.6mL,底物终浓度分别为0.005、0.02、0.1、0.5、2.0mmol/L。计算方法参照Wilkinson(1961)。1.4.2甲酸乙酯溶液配制取未用药剂熏蒸过的米象成虫,按与活体测定相同的方法提取酶液。以丙酮为溶剂,先将甲酸乙酯配成0.1、1、10mL/L和100mL/L的不同浓度,在反应体系中预加入0.1mL上述4种浓度的药液,再与酶液混合保温,其他同活体测定。1.5丙烯酸酶care的活性测试1.5.1方面活性成分稳定机理,制备标准曲线,三复制液、水液-液法。请看参照vanAspern的方法。试虫处理同AChE活体测定,取10头处理过的米象成虫,加入预冷的pH7.0、0.04mol/L的磷酸缓冲液1.2mL,于冰浴条件下匀浆,匀浆液在4℃、10000g条件下离心15min,取上清液冰浴,稀释3倍后测定CarE活性,母液用于测定蛋白质含量。用α-萘酚制作标准曲线。以α-乙酸萘酯(α-NA)(3×10-4mol/L)作底物,经羧酸酯酶水解后生成α-萘酚,与显色剂V(1%坚固蓝B)∶V(5%SDS)=2∶5,可生成深蓝色物质,在600nm处测OD值。根据制作的标准曲线和酶原蛋白含量的测定结果,将OD值换算成比活力(μmol/mg·30min)。1.5.2酶液的提取取未熏蒸过的米象成虫按与活体测定相同的方法提取酶液。药剂与酶液的处理和AChE离体测定相似,再按与CarE活体测定相同的方法分别测定OD值,计算比活力。1.6测定蛋白质含量参照Bradford考马斯亮蓝G-250染色法测定。2结果与分析2.1不同ph的保鲜剂对过多酚主动生长的效果甲酸乙酯对米象表现出很高的毒力,尤其在短时间内就能发挥很好的杀虫效果,在熏蒸处理24h后其LC50为28.650μL/L,处理48h后LC50为25.805μL/L(表1)。2.2乙酰胆碱酯的酶活性2.2.1合成纤维/双环芳烃处理对ache比活力的影响活体条件下未用药处理的米象成虫体内AChE活力变化较小,而处理试虫的酶活性差异显著,表现为抑制作用(表2)。在相同处理时间下随着药剂浓度的增大AChE的比活力逐渐降低,10μL/L的甲酸乙酯处理米象16h后,AChE的比活力由15.469nmol/mg·min降至13.288nmol/mg·min,而在20μL/L的浓度下处理时则降至9.264nmol/mg·min;在相同的药剂浓度下随着处理时间的延长AChE的比活力也逐渐降低,15μL/L的甲酸乙酯处理米象4h后AChE的比活力由15.452nmol/mg·min降至12.678nmol/mg·min,而处理24h后则由15.684nmol/mg·min降至10.663nmol/mg·min。2.2.2药剂对ache活性的影响从表3可以看出,在离体条件下甲酸乙酯对米象AChE的活性影响较小,尽管药剂处理后米象AChE活性略有提高,但与对照相比差异并不显著,不同药剂浓度造成AChE活性差异亦未达到显著水平(p>0.05)。2.2.3改变ay酶促反应动力学研究表明,用甲酸乙酯处理后米象成虫体内AChE的Km值明显变大,15μL/L和20μL/L的甲酸乙酯处理8h使Km值从6.058×10-3mmol/L增大至8.069×10-3mmol/L和1.728×10-2mmol/L,表明甲酸乙酯的抑制降低了AChE对底物ATChI的亲和力。2.3丙烯酸酶活性2.3.1药剂浓度对力表4表明,用10、15、20μL/L的甲酸乙酯处理试虫4h和8h后,米象体内CarE的比活力均显著低于对照,而不同药剂浓度间差异不显著(p>0.05)。当处理时间增加至16h后,米象体内CarE的比活力均高于对照,但其差异并不显著(p>0.05)。当处理时间延长到24h后,20μL/L的浓度下米象体内CarE的比活力显著低于对照(p<0.05),其他浓度与对照间差异不明显。2.3.2甲醇乙酯溶液对甲醛乙酯抑制剂抑制率的影响离体条件下甲酸乙酯对米象CarE比活力有显著抑制作用(p<0.05),且表现为在一定药剂浓度范围内,随甲酸乙酯浓度的增高抑制能力增强的趋势(表5)。0.1mL/L的甲酸乙酯对CarE比活力的抑制率为3.256%,10mL/L的浓度下抑制率为10.73%,100mL/L的抑制率为21.201%。3甲醛乙酯对ache活性的影响甲酸乙酯对米象成虫的熏蒸活性结果表明,甲酸乙酯对米象表现出较强的速效性,熏蒸24h后其LC50为28.650μL/L,处理48h后LC50为25.805μL/L。乙酰胆碱酯酶(AChE)是动物体内广泛存在的在神经兴奋传递过程中起重要作用的一种酶,能通过水解突触间隙的乙酰胆碱,而终止神经兴奋的传导,此酶一旦被抑制达到一定程度时,会使动物过度兴奋而死亡。测定甲酸乙酯对AChE活性的影响,结果表明在15、20μL/L的浓度下甲酸乙酯对AChE具有显著的抑制活性,且随着药剂浓度的增大和处理时间的延长抑制作用越明显,酶动力学研究表明,甲酸乙酯还可以使AChE与底物ATChI的亲和力下降,说明甲酸乙酯可能是通过影响了AChE的性质从而发挥其杀虫活性的;但是在离体条件下的影响却不显著,表明甲酸乙酯本身可能对AChE没有明显的抑制作用,而在米象体内被代谢后的产物却能明显抑制AChE的活性。羧酸酯酶是昆虫体内一种主要的代谢解毒酶,该酶具有广泛的底物专一性和重叠性,能催化水解脂肪族羧酸酯、芳酸酯及相应的硫代酯等