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文档简介

熟地黄提取液对酪氨酸酶的抑制作用研究仪器和药品：仪器：分光光度计、微量移液器（1ml）、电子天平、容量瓶（10ml、50ml、250ml）、回流装置一套、沸石、抽滤装置、旋转蒸发仪、水浴恒温箱、烧杯和量筒若干。药品：熟地黄粉末（约50g）、体积分数50%的乙醇（200ml）、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、L-酪氨酸、酪氨酸酶、去离子水若干。实验方案：A、熟地黄有效成分的提取：1、干燥熟地黄粉末10.0g+体积分数50%的乙醇100mL，室温浸泡24h。2、烧瓶+沸石+上述浸泡液，回流提取3h，冷却后抽滤取滤液。残渣再次加50%乙醇100mL回流提取3h，冷却抽滤取滤液，合并两次滤液。（回流温度约80℃。）3、将滤液置于旋转蒸发仪上60-65℃浓缩回收溶剂，得膏状提取物。4、称取适量膏状提取物+去离子水配置成1mg/mL溶液备用。B、磷酸缓冲溶液（PBS）的配制：1、称取磷酸氢二钠13.3984g，加去离子水溶解，转移至250mL容量瓶中定容得a液；另称取磷酸二氢钠6.9011g，加去离子水溶解，转移至250mL容量瓶中定容得b液。2、分别移取a、b两溶液各50mL至250mL容量瓶中，加去离子水定容，即得pH=6.8的磷酸缓冲溶液。C、L-酪氨酸溶液和酪氨酸酶溶液的配制：1、称取L-酪氨酸25.6g，用PBS缓冲液定容于50mL容量瓶中，即得L-酪氨酸溶液。2、称取酪氨酸酶0.3502g，用PBS缓冲液定容于10mL容量瓶中，即得酪氨酸酶溶液。（冰水浴中操作、保存。）D、酪氨酸酶活力的测定：（分光光度法测A475）用微量移液器分别按表一剂量准确移取a、b、c、d四组样液，置于37℃水浴中恒温10min后，各加入0.40mL酪氨酸酶溶液，混匀，37℃温育反应10min，迅速移入比色皿中，测得在475nm处的吸光度Aa、Ab、Ac、Ad，然后按下面的公式计算熟地提取液对酪氨酸酶的抑制率：抑制率=[1-（Ad-Ac）/（Ab-Aa）]×100%表一反应液的组成（单位：ml）待测液abcdL-酪氨酸0.000.800.000.80水*/提取物0.80*0.80*0.800.80PBS缓冲液1.400.601.400.60酪氨酸酶0.400.400.400.40合计2.602.602.602.60其中：a：既无底物也无提取物的待测液；b：有底物但无提取物的待测液；c：无底物但有提取物的待测液；d：既有底物也有提取物的待测液。E、扩展研究：（测定不同浓度提取物对酶的抑制作用影响）保持待测液各组分一样，仅仅是加入不同浓度的提取物，读取从开始2min后在475nm处的吸

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