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![酪氨酸抑制性测定实验方案_第2页](http://file4.renrendoc.com/view/ebaa0ed121b95a34308dea0756b1e2c7/ebaa0ed121b95a34308dea0756b1e2c72.gif)
![酪氨酸抑制性测定实验方案_第3页](http://file4.renrendoc.com/view/ebaa0ed121b95a34308dea0756b1e2c7/ebaa0ed121b95a34308dea0756b1e2c73.gif)
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文档简介
熟地黄提取液对酪氨酸酶的抑制作用研究仪器和药品:仪器:分光光度计、微量移液器(1ml)、电子天平、容量瓶(10ml、50ml、250ml)、回流装置一套、沸石、抽滤装置、旋转蒸发仪、水浴恒温箱、烧杯和量筒若干。药品:熟地黄粉末(约50g)、体积分数50%的乙醇(200ml)、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、L-酪氨酸、酪氨酸酶、去离子水若干。实验方案:A、熟地黄有效成分的提取:1、干燥熟地黄粉末10.0g+体积分数50%的乙醇100mL,室温浸泡24h。2、烧瓶+沸石+上述浸泡液,回流提取3h,冷却后抽滤取滤液。残渣再次加50%乙醇100mL回流提取3h,冷却抽滤取滤液,合并两次滤液。(回流温度约80℃。)3、将滤液置于旋转蒸发仪上60-65℃浓缩回收溶剂,得膏状提取物。4、称取适量膏状提取物+去离子水配置成1mg/mL溶液备用。B、磷酸缓冲溶液(PBS)的配制:1、称取磷酸氢二钠13.3984g,加去离子水溶解,转移至250mL容量瓶中定容得a液;另称取磷酸二氢钠6.9011g,加去离子水溶解,转移至250mL容量瓶中定容得b液。2、分别移取a、b两溶液各50mL至250mL容量瓶中,加去离子水定容,即得pH=6.8的磷酸缓冲溶液。C、L-酪氨酸溶液和酪氨酸酶溶液的配制:1、称取L-酪氨酸25.6g,用PBS缓冲液定容于50mL容量瓶中,即得L-酪氨酸溶液。2、称取酪氨酸酶0.3502g,用PBS缓冲液定容于10mL容量瓶中,即得酪氨酸酶溶液。(冰水浴中操作、保存。)D、酪氨酸酶活力的测定:(分光光度法测A475)用微量移液器分别按表一剂量准确移取a、b、c、d四组样液,置于37℃水浴中恒温10min后,各加入0.40mL酪氨酸酶溶液,混匀,37℃温育反应10min,迅速移入比色皿中,测得在475nm处的吸光度Aa、Ab、Ac、Ad,然后按下面的公式计算熟地提取液对酪氨酸酶的抑制率:抑制率=[1-(Ad-Ac)/(Ab-Aa)]×100%表一反应液的组成(单位:ml)待测液abcdL-酪氨酸0.000.800.000.80水*/提取物0.80*0.80*0.800.80PBS缓冲液1.400.601.400.60酪氨酸酶0.400.400.400.40合计2.602.602.602.60其中:a:既无底物也无提取物的待测液;b:有底物但无提取物的待测液;c:无底物但有提取物的待测液;d:既有底物也有提取物的待测液。E、扩展研究:(测定不同浓度提取物对酶的抑制作用影响)保持待测液各组分一样,仅仅是加入不同浓度的提取物,读取从开始2min后在475nm处的吸
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