大鼠原代肝细胞、星状细胞、枯否细胞和肝窦内皮细胞的同步分离与培养

大鼠原代肝细胞、星状细胞、枯否细胞和肝窦内皮细胞的同步分离与培养

01引言结果材料和方法讨论目录030204引言引言肝脏是人体最重要的代谢器官之一，其结构和功能在维持机体正常生理代谢中具有重要意义。在肝脏中，各种细胞类型如肝原代肝细胞、星状细胞、枯否细胞和肝窦内皮细胞等相互协作，共同参与了肝脏的代谢、排泄、免疫和血流量调节等过程。为了更好地研究肝脏的生理和病理过程，需要对这些不同类型的细胞进行分离和培养。引言本次演示将介绍一种同步分离与培养大鼠原代肝细胞、星状细胞、枯否细胞和肝窦内皮细胞的方法，为相关研究提供参考。材料和方法1、材料1、材料实验动物：健康雄性SD大鼠细胞培养试剂：DMEM/F12、Hank's溶液、0.25%胰蛋白酶、胶原酶、EDTA、FBS细胞分离试剂：DispaseⅡ、EGTA、BSA、NaN3细胞培养设备：细胞培养箱、倒置显微镜、酶标仪等2、方法（1）动物处理（1）动物处理将SD大鼠断头处死，剥离肝脏，置于Hank's溶液中清洗，去除血液和杂质。（2）肝组织预处理（2）肝组织预处理将肝脏组织剪成1cm×1cm的小块，用DispaseⅡ和EGTA消化，分离出肝窦内皮细胞。（3）肝细胞分离（3）肝细胞分离将肝脏组织剪成1mm×1mm的小块，用胶原酶消化，分离出肝原代肝细胞和星状细胞。采用两步胶原酶消化法，即先加入低浓度胶原酶消化30分钟，再加入高浓度胶原酶消化30分钟。在消化过程中需不断摇晃以使组织充分消化。消化完成后，用滤网过滤，收集细胞悬液。（4）枯否细胞分离（4）枯否细胞分离将上述细胞悬液离心，弃上清液，用含BSA的生理盐水洗涤，再加入含NaN3的生理盐水去除红细胞。然后用含BSA的生理盐水洗涤并离心，弃上清液。最后加入DMEM/F12培养基，将沉淀的枯否细胞分散开。（5）细胞培养（5）细胞培养将上述分离得到的肝原代肝细胞、星状细胞、枯否细胞和肝窦内皮细胞分别接种于培养瓶中，加入适量DMEM/F12培养基，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。根据细胞生长情况适时更换培养基，传代培养。结果1、细胞形态1、细胞形态通过倒置显微镜观察各细胞的形态学特征，结果显示肝原代肝细胞呈多角形或圆形，胞质丰富，胞核较大；星状细胞呈长梭形或椭圆形，胞质伸出多个突起；枯否细胞呈不规则形状，胞质丰富，胞核较小；肝窦内皮细胞呈长梭形或多角形，形成单层细胞。2、细胞数量和存活率2、细胞数量和存活率通过细胞计数和台盼蓝染色法测定细胞的存活率，结果显示各细胞类型的数量和存活率均较高，肝窦内皮细胞的存活率略低于其他三种细胞。3、基因表达3、基因表达采用qRT-PCR方法检测各细胞中特定基因的表达情况。结果显示肝原代肝细胞中白蛋白（ALB）和胆固醇合成酶（HMGCS）基因表达较高；星状细胞中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和转化生长因子-β1（TGF-β1）基因表达较高；枯否细胞中髓过氧化物酶（MPO）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）基因表达较高；肝窦内皮细胞中血管内皮生长因子（VEGF）和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因表达较高。这表明四种细胞在不同基因表达水平上具有功能差异。讨论讨论本研究成功地同步分离与培养了大鼠原代肝细胞、星状细胞、枯否细胞和肝窦内皮细胞，为研究肝脏的生理和病理过程提供了可靠的实验模型。实验结果显示，各细胞类型的形态、数量、存活率和基因表达均具有特征性差异。这些差异表明它们在肝脏中的功能和作用是不同的。讨论例如，肝原代肝细