第十章 转基因动物与生物反应器

第十章

转基因动物与生物反应器10.1转基因技术

基因工程技术：按照人们的意愿，重组DNA（一种生物DNA中的遗传密码片段连接到另一种生物的DNA链上），设计新的遗传物质，创造新的物种。转基因技术：通过人工操作的方法将外源基因整合到生物体基因组内，使该转基因生物能稳定地表达并将此基因遗传给后代的实验技术。10.1.1细胞转染外源基因的方法

常用的哺乳动物细胞转染（接受外源基因）的方法有两种：1.

暂时转染：质粒在宿主细胞内不必停留很长时间，DNA转录成mRNA，翻译成蛋白质，并不进入基因组。如磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖法、脂质体载体发等。2.

永久性转染：逆转录病毒载体法可产生永久有效的转染。10.1.1细胞转染外源基因的方法

基因转移的方法：物理、化学和生物方法。一、物理方法1.电穿孔法：利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，在细胞膜上形成纳米级的微孔。从而使外源DNA不经过胞饮作用直接转移至细胞中。2.微注射法：通过激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄鼠交配，处死雌鼠取出受精卵。借助显微镜将纯化的DNA溶液迅速注入受精卵中变大的雄核内，将受精卵移植到另外一只假受孕的母鼠的输卵管内，正常发育、繁殖出转基因鼠。10.1.1细胞转染外源基因的方法

3.裸露DNA直接注射法将裸露DNA直接注射到组织中，DNA有可能直接被细胞所摄入。最简单，但效率低。二、化学方法生1、DEAE-葡聚糖法将外源DNA片段与DEAE——葡聚糖等高分子碳水化合物混合，这样DNA链上带负电的磷酸骨架便被吸附于DEAE的正电荷基团上。2.磷酸钙-DNA共沉淀法：磷酸缓冲液（pH7.1）溶解DNA，加氯化钙，磷酸钙与DNA共沉淀形成大颗粒。通过钙、磷诱导细胞吞噬或脂相收缩的空隙，DNA进入细胞。3.脂质体载体包埋法：人工膜泡（载体）包裹DNA，与受体细胞融合。三、生物学方法：病毒介导的基因转移。常用的病毒载体包括DNA病毒载体、逆转录病毒载体等。

反转录病毒载体可稳定、长期表达外源基因。载体通常含有一个选择性标记和要表达的外源基因。由于病毒的大部分结构基因已经被除去，这种载体不能自我复制。将克隆的原病毒DNA转染进包装细胞中产生病毒原种，病毒原种缺少复制功能，但能感染培养靶细胞，从而有效地诱导出重组基因组，即反转录出DNA，并插入细胞基因组中。但病毒载体有缺陷：所有病毒载体都会诱导产生一定程度的免疫反应；或多或少存在安全隐患；转导能力有限，不适合大规模生产。10.1.2转染细胞的鉴定

可设计含有抗药性基因的外源DNA载体，然后通过选择性培养基进行转染细胞的筛选。也可通过提取转染细胞的DNA，以适当限制性内切酶酶切后进行Southern转移分析，检验细胞中是否有被转移的外源基因。10.2转基因动物转基因动物（transgenicanimal）：在基因组内稳定地整合以实验方法导入的外源基因，并且外源基因可以稳定地表达和遗传给后代的遗传工程动物。10.2.1发展历史

1974年，贾英利斯和明茨应用显微注射法，在世界上首次获得AV40DNA转基因小鼠。1980年，戈登等人首次育成带有人胸苷激酶基因的转移小鼠。1982年，帕尔米特等人将大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵的雄原核中，获得比普通对照小鼠生长速度快2~4倍、体形大一倍的转基因“硕鼠”。随后的几十年里，转基因动物技术飞速发展。10.2.2转基因动物的制备

一、原理与方法

生产转基因动物的关键技术：外源目的基因制备；外源目的基因有效的导入生殖细胞或胚胎干细胞；选择获得携有目的基因的细胞；选择合适的体外培养系统和宿主动物；转基因细胞胚胎发育及鉴定；筛选所得的转基因动物品系。10.2.2转基因动物的制备

方法：1.

原核期胚胎显微注射法2.

反转录病毒感染法3.

胚胎干细胞方法4.

精子载体法：精子与DNA混培养，精子携带DNA进入卵子5.

人工酵母染色体法：百万碱基对的巨大基因，整合率较高6.

受精前卵细胞显微注射法7.

其他方法：电脉冲法、染色体片段注入法、磷酸钙共沉淀法、微弹轰击法、基因剔除、基因嵌入等3种转基因的方法及其与发育阶段的关系：

DNA反转录病毒感染或DNA转染或电转移胚胎干细胞显微注射囊胚受精卵四细胞期原肠胚转基因动物DNA显微注射DNA反转录病毒感染转基因动物鉴定技术：早期采用的、也是目前最有权威性的转基因动物鉴定技术是Southernblot。提取待检动物组织的染色体消化后电脉，转膜后选择适当的探针进行杂交，通过放射自显影获得结果。

斑点杂交：提取动物DNA，点于硝酸纤维素膜，探针杂交，放射自显影。

聚合酶链式反应（PCR）：PCR扩增产物序列分析即可鉴定。

染色体原位杂交：（？）目的基因的制备目的基因的来源1.采用限制性内切酶，从基因细胞中获取目的基因2.通过mRNA合成cDNA3.人工体外合成DNA片段4.聚合酶链式反应（PCR）扩增特定基因片段目的基因的克隆1.通过载体在适当的宿主中克隆（1）基因克隆的载体载体的选择与改造应具备：提供在适当宿主细胞中复制的信号，或能整合到宿主染色体上与基因组一起复制；有增殖非必须的DNA区域，并含单个内切酶位点，以便外源DNA共价连接（插入或取代该区段），形成重组子可在宿主细胞内复制和增殖；分子量不宜过大，以便于DNA体外操作；载体DNA易与宿主核酸分开，便于提纯；具有筛选标记，以区别阳性重组子和阴性重组子，选择标记包括抗药性基因、酶基因、营养缺陷型、形成噬菌斑的能力等。目的基因的克隆

（1）基因克隆的载体质粒载体：质粒是细菌染色体外小型双链环状DNA复制子，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型有一定作用。λ噬菌体载体：λ噬菌体是一种双链DNA噬菌体，基因组约有50kb，在λ噬菌体颗粒中分离出来的DNA为线性双链分子，在分子两端各有12个碱基的互补单链顺序，是天然的粘性末端。

粘粒载体：由质粒和噬菌体的粘性末端构建而成。由于噬菌体载体容量仍受一定限制，最大插入片段不能超过23kb。粘粒载体：质粒复制起始位点、1个或多个限制性内切酶位点、抗药性标记、带有粘性末端的DNA片段。大小4~6kb，插入2945kb。（2）目的基因与载体DNA间的连接1）粘端连接反应方法

2）平断连接反应方法（3）重组载体导入受体细胞氯化钙转化法2.通过PCR反应克隆目的细胞

在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。10.2.3转基因动物技术的意义与最新进展

转基因动物技术的意义：1、建立人类疾病动物模型；2、加速动物育种；3、研究真核生物基因表达调控机理；4、哺乳动物特异组织系统生产人用药用蛋白、细胞、组织、器官。10.2.3转基因动物技术的意义与最新进展

优良动物育种：1.

快速生长与肉质改善2.

抵抗疾病3.

增加羊毛产量和性能4.

抗冻品种培育10.2.3转基因动物技术的意义与最新进展

在医药领域的应用：1.

抗出血性药物2.

抗凝血药物3.血栓治疗药物4.肺气肿治疗药物5