细胞工程与基因工程育种

第十八章细胞工程与基因工程育种植物离体培养的概念与应用:组织与器官培养:花药和花粉培养与单倍体育种:植物细胞培养及其突变体筛选:原生质体培养与体细胞杂交:山东中医药大学药学院植物离体培养的概念与应用植物离体培养的概念：植物离体培养的类型：植物离体培养在药用植物育种中的应用：Back山东中医药大学药学院植物离体培养：即广义的植物组织培养，是指通过无菌操作，将植物的组织、器官、细胞以及原生质体等接种于人工配制的培养基上，在人工控制的环境条件下进行培养，以获得再生的完整植株和生产具有经济价值的其他生物产品的一种技术。是现代生物技术的一个重要组成部分。Back山东中医药大学药学院生物技术（biotechnology、生物工程或生物工艺学)：是指以生命科学为基础，利用生物体系和工程原理创造新品种和生产生物制品的综合性科学技术。基因工程细胞工程酶工程发酵工程生物化学工程蛋白质工程Back山东中医药大学药学院基因工程：就是将生物体的遗传物质（DNA）取出进行体外操作，包括基因的分离、剪切、拼接、组合，然后将其转入寄主细胞，外源基因在寄主细胞内大量复制、表达，从而使寄主具有新的遗传性。基因工程是按照人们的预想重新设计生命。因为是遗传物质的重新组合，所以也叫重组DNA工程Back山东中医药大学药学院细胞工程：是以细胞为基本单位在离体条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞某些生物学特性按照人们的意愿发生改变，从而改良生物品种和创造新种，或加速繁育动植物个体或获得有用物质的过程。细胞工程包括的内容有细胞融合技术、组织培养技术、细胞器移植技术和染色体工程技术。Back山东中医药大学药学院酶工程：指利用酶、细胞和细胞器所具有的某些特异催化功能，借助生物反应器和工艺过程来生产人类所需要的产品的一种技术。

发酵工程：指给微生物提供最适宜的生长条件，利用微生物的某种特定的功能，通过现代化工程技术手段生产人类需要的产品。又称微生物工程。Back山东中医药大学药学院生物化学工程：简称生化工程，是由生物科学与化学工程相结合的交叉学科，主要研究将生物技术的实验室研究成果转化为生产力过程中的带有共性的工程技术问题。

蛋白质工程：指利用生物技术手段对蛋白质的DNA编码序列进行有目的的改造并分离、纯化蛋白质，从而获取自然界没有的、具有优良性质或适用于工业生产条件的全新蛋白质的技术。Back山东中医药大学药学院植物离体培养的类型（按外植体的种类和培养目的来分）:胚胎培养组织培养器官培养花粉培养与花药培养细胞培养原生质体培养Back山东中医药大学药学院外植体：在离体条件下，分离下来进行培养的部分称为外植体。Back山东中医药大学药学院植物离体培养在药用植物育种中的应用扩大变异范围克服远缘杂交的一些障碍获得体细胞杂种倍性控制突变的诱导和离体选择加速亲本材料的纯化快速无性繁殖获得脱毒苗种质资源的试管保存可作为外源基因转化的受体系统Back山东中医药大学药学院组织与器官培养实验室无菌操作室培养室化学实验室、洗涤消毒室和细胞学实验室培养条件步骤与方法Back山东中医药大学药学院培养条件培养基无菌操作培养的环境条件Back山东中医药大学药学院培养基种类固体培养基液体培养基营养成分配方：常用的有MS、ER、B5、SH、HE等。配制洗涤母液的配制配制步骤Back山东中医药大学药学院营养成分无机成分大量元素：N、P、K、Ca、Mg、S等。微量元素：Fe、Na、Mn、B、Zn、Cu、Mo、I等有机成分天然复合物：常用的有椰乳、酵母提取物、水解酪蛋白等，还有番茄汁、黄瓜汁、橙汁、马铃薯汁等。植物生长调节剂生长素：常用的有2,4-D、NAA、IAA、IBA等细胞分裂素：常用的有6-BA、KT、ZT等赤霉素：GA3Back山东中医药大学药学院有机成分能量物质：常用2%~3%蔗糖氨基酸：常用甘氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、精氨酸、酪氨酸、谷氨酸、天冬酰胺等维生素：常用Vc、VB1、VB6、生物素、烟酸、叶酸、肌醇等。Back山东中医药大学药学院无菌操作污染来源培养基及玻璃器皿无菌操作室、所用器械外植体材料的消毒消毒剂的种类：Ca(Cl0)2、NaClO、H2O2、AgNO3、HgCl2、酒精等消毒方法：材料修整——流水冲洗——药剂消毒（常用75%乙醇浸渍30s——0.1%升汞浸泡2~10min或2%~10%NaClO浸泡10~30min——无菌蒸馏水冲洗3~5次）Back山东中医药大学药学院培养的环境条件光照：白色荧光灯，光强1000~5000Lx，12~16hr，用自动定时器控制光照时间温度：多为25±2℃湿度：容器内湿度：100%环境湿度：要求70%~80%Back山东中医药大学药学院组织培养的步骤与方法无菌培养的建立营养繁殖体的增殖诱导腋芽的发生诱导产生不定芽体细胞胚胎发生生根试管苗移栽大田Back山东中医药大学药学院花药和花粉培养与单倍体育种单倍体在植物育种上的重要性花药和花粉培养技术单倍体植株的染色体加倍自然加倍人工诱导加倍从愈伤组织再生二倍体植株Back山东中医药大学药学院单倍体在植物育种上的重要性单倍体染色体加倍可获得纯合二倍体有利于远缘杂交新类型的培育和稳定与诱变育种相结合可加速育种进程可作为外源基因转化的受体系统Back山东中医药大学药学院花药和花粉培养技术花药培养材料的选取材料灭菌接种培养再生单倍体植株花粉培养:影响花药及花粉培养的因素Back山东中医药大学药学院花粉培养花粉的分离机械分离法自然散落法花粉的培养浅层液体培养法看护培养法Back山东中医药大学药学院影响花药及花粉培养的因素供体植株的基因型培养基小孢子发育阶段供体植株的生理状态及培养前的预处理培养方式Back山东中医药大学药学院植物细胞培养及其突变体筛选单细胞培养单离细胞的方法：单细胞培养方法：培养细胞的密度及活力测定：细胞突变体的筛选：Back山东中医药大学药学院单离细胞的方法物理方法化学方法酶法Back山东中医药大学药学院单细胞培养方法液体浅层培养微滴培养平板培养看护培养饲喂层培养条件培养Back山东中医药大学药学院培养细胞的密度及活力测定起始培养的细胞密度：每毫升培养液104~108个细胞细胞活力测定：染色法荧光素双醋酸盐（FDA）酚藏花红Evansblue(Evans蓝）植板率的测定：Back山东中医药大学药学院植板率：每个平板接种细胞总数中形成细胞团的百分率植板率=每平板形成的细胞团数/每平板接种的细胞总数×100%每平板接种的细胞总数=每毫升培养液中的细胞数目X该平板细胞培养液的毫升数每平板形成的细胞团数计数方法低倍显微镜下直接计算细胞团显影法Back山东中医药大学药学院细胞突变体的筛选细胞突变体筛选的一般技术细胞材料的选择诱发突变的方法突变细胞的选择方法突变性状的遗传基础及其稳定性鉴定农业上有用性状的突变体离体筛选对病害的抗性对土壤障碍的抗耐性对除草剂的抗性对温度的抗耐性Back山东中医药大学药学院植物原生质体：是指除去细胞壁的由质膜包裹着的具有生活力的裸细胞。原生质体融合：也称体细胞杂交，指使不同的原生质体相互融合形成杂种细胞，再经过人工培养诱导杂种细胞分化形成植株的过程。山东中医药大学药学院原生质体培养与体细胞杂交原生质体的分离原生质体的培养原生质体的融合原生质体融合体的发育及杂种细胞的筛选体细胞杂种植株的再生及其鉴定山东中医药大学药学院原生质体的分离分离原生质体的材料来源叶肉组织，无菌苗的子叶，愈伤组织及悬浮细胞最常用。分离植物原生质体的酶原生质体分离的操作程序山东中医药大学药学院原生质体的培养原生质体的培养