碱性磷酸酶-基因实验

编号蒙古大学生命科学学院生物系

基因工程实验室本科基因工程实验论文开题报告论文题目：碱性磷酸酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达学生姓名： 年 级：专 业：指导教师： 二0一三年八月十二日学生姓名论文题目开题时间项目来源 本科生基因工程大实验课一、立论依据项目的研究意义，国内外研究现状及发展趋势分析，主要参考文献及出处:碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP,ALKP)(EC3.1.3.1)属磷酸单脂酶族，底物专一性较低，广泛应用于表位连锁图谱，探针标记测序和免疫组织化学等领域。分子生物学中，ALP分解寡聚核甘酸的末端单酯化磷酸，是常用的遗传工程酶。1产碱性磷酸酶的生物有很多，从细菌到高等哺乳动物均有分布。人血液中的碱性磷酸酶含量是重要的指标之一，其检验结果及异位表达对癌症等许多疾病有着指导意义。2,3目前商业碱性磷酸酶主要来源于动物(小牛肠碱性磷酸酶)、植物(麦芽)和微生物(细菌碱性磷酸酶)(Bacterialalkalinephosphatase,BAP)。在革兰氏阴性细菌中，BAP表达于细胞膜外的周质空间。相比表达于胞内使其更机动和高效。BAP的功能已基本揭示，简单来说BAP是细菌产生摄取应用的自由磷酸基团的一种方式，4被大量的实验证据所支持。然而，缺乏BAP的E.coli仍然能够存活，所以应该还存在相关的替代机制。5目前，对BAP的研究热点主要由于其海洋有机磷利用的酶特性等集中于海洋微生物领域。海洋细菌碱性磷酸酶的亚细胞研究揭示了其相关合成基因及表达特性对于海洋有机磷循环及海洋生物多样性的贡献。研究人员证实了3733种BAP序列(包括PhoA,PhoD,andPhoX)，包含胞质分泌及胞外位于不同支载结构。大量的实验数据支持了细菌于海洋表面部分光耦合的磷摄取机制。6鉴于磷对于海洋维持初级产能的重要性，并且考虑到其最主要的来源之一一有机磷分解，海洋生物BAP的分子生物学研究也是热点之一。相关的酶动力学研究表明，与藻青菌相关的碱性磷酸酶来说，钙对于维持其基本活性是必须的。有假说称其与浮游植物可能是锌-P共限制的，一些海洋细菌的BAP可选形式即PhoX是于此相关的。7此外，分子研究表明，移除BAP的3’磷酸集团能够促进碰撞诱导解离时RNase消化产物分析对的寡核苷酸覆盖。8另外，ALP于哺乳动物的分子酶动力学研究与海洋BAP也取得了相应的结果。外生碱性磷酸酶处理补充了结肠炎的内生酶保护机制以及抑制了细菌对大鼠的转座。为AP抵制细菌转座作用补充了证据。9本研究对BAP进行克隆及表达研究，能够为进一步的科研研究提供原料，具有一定的经济价值，并无较大科研价值。参考文献：l.Tamas,L.,Huttova,J.,Mistrk,I.,Kogan,G.(2002)EectofCarboxymethylChitin-GlucanontheActivityofSomeHydrolyticEnzymesinMaizePlants.Chem.Pap.56(5):326-329.2.Stolbach,L.L.,Krant,M.J.,Fishman,W.H.(1969)EctopicProductionofanAlkalinePhosphataseIsoenzymeinPatientswithCancer.NEnglJMed.281:757-762.Diener,H.C.,Bogousslavsky,J.,Brass,L.M.(2004)Aspirinandclopidogrelcom-paredwithclopidogrelaloneafterrecentischaemicstrokeortransientischaemicattackinhigh-riskpatients(MATCH):ran-domised,double-blind,placebo-controlledtrial.Lancet.364:331-733.Horiuchi,T.,Horiuchi,S.,Mizuno,D.(1959).APossibleNegativeFeedbackPhenomenoncontrollingFormationofAlkalinePhosphomonoesteraseinEscherichiacoli.Nature.183:1529-1530.Wanner,B.L.,PatrickL.(1980).MutantsAffectedinAlkalinePhosphataseExpression:EvidenceforMultiplePositiveRegulatorsofthePhosphateReguloninEscherzchzaColi.Genetics96(2):353-366.Luo,H.W.,Bennera,R.,Long,R.A.,andHu,J.J.(2009)Subcellularlocalizationofmarinebacterialalkalinephosphatases.ProcNatlAcadSci106：21219-21223.Kathuria,S.,Martiny,A.C.(2012)Prevalenceofacalcium-basedalkalinephosphataseassociatedwiththemarinecyanobacteriumProchlorococcusandotheroceanbacteria.EnvMicrobiol.13:4-83.Krivos,K.L.,Addepalli,B.,Limbach,P.A.(2011)RejuhosplhategtoupbybacterialalkalinephosphataseimprovesoligonucleotidesequencecoverageofRNasedigestionproductsanalyzedbycollision-induceddissociationmassspectrometry.RapidCommunMassSpectrom.25:3609-3616.Martinez-Moya,P.,Ortega-Gonzalez,M.,Gonzalez,R.,Anzola,A.,Ocon,B.,Hernandez-Chirlaque,C.,etal.(2012).Exogenousalkalinephosphatasetreatmentcomplementsendogenousenzymeprotectionincolonicinflammationandreducesbacterialtranslocationinrats.PharmacolRes.66:144-153.

实验进度（10天之内）：前一夜摇菌。第一天：提取pET-His,pCDNA-BAP；2琼脂糖凝胶电泳鉴定pET-His,pCDNA-BAP；3以pCDNA-BAP为模版扩增目的基因片段。4酶切pET-His。第二天1凝胶回收酶切片段；PCR产物连接；转化E.coli；4摇菌。第三天1IPTG诱导表达；2提BAP蛋白；3SDS鉴定。预期实验成果：1获得目的产物BAP；2成功构建BAP表达载体;3撰写实验报告。曾参