第八章 植物基因工程

转基因植物—是通过DNA重组技术，从生物体(动物、植物、微生物）中鉴定和分离特定的基因，经精心设计后导入并使其稳定整合于受体植物的基因组，表达后实现对植物的定向遗传改造而获得的植物。

第八章、外源基因在植物中表达

转基因植物研究的目的转基因植物研究的目的：为了获得抗除草剂、抗病虫害、改善品质、提高产量与适应逆境等更为理想的植物.传统育种与基因工程育种的异同：传统育种方法速度慢，基因工程育种较快。传统育种只适合能进行有性杂交的植物，而基因工程育种可将特定的基因导入同种、近缘甚至远缘物种的基因组中。传统育种可将其他不需要的基因引入植物基因组中

再生植株---通过组培,由愈伤组织、悬浮细胞或原生质体生长的完整植株,称为再生植株.愈伤组织---外植体在适宜的培养基中生长出未分化的细胞团，称为愈伤组织.根瘤存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中，诱导冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒（tumorinducingplasmid）。1.Ti质粒:

Tiplasmid环状双链DNA，1.5×105-2.0×105bp（185kb）(相当于细菌染色体的3%-5%）。（1）Ti质粒的结构

转移DNA，编码冠瘿碱的合成，能随机整合到植物的染色体上。长度一般为12-24kb，是Ti质粒最重要的部分。左边界右边界生长素基因细胞分裂素基因冠瘿碱合成①T-DNA（transfer-DNA）生长素基因:iaaM（tms1）和iaaH（tms2）编码合成吲哚乙酸（植物生长激素）的酶iaaM:色氨酸-2-单加氧酶色氨酸-2-单加氧酶色氨酸吲哚-3-乙酰胺iaaH:吲哚-3-乙酰胺水解酶吲哚-3-乙酰胺水解酶吲哚-3-乙酰胺吲哚乙酸细胞分裂素基因tmr（ipt）：异戊烯转移酶,催化：二磷酸异戊烯（IPP）异戊烯酰嘌呤单磷酸（IPA）5’-AMP章鱼碱（octopine)胭脂碱（nopaline）NH-(CH2)3-CH-COOHNHCH3-CH-COOHHN=CNH2NH-(CH2)3-CH-COOHNHHOOC-(CH2)2-CH-COOHHN=CNH2Arg与丙酮酸缩合成Arg与

酮戊二醛缩合成冠瘿碱（opine）的类型和化学结构农杆碱（agropine）冠瘿碱（opine）的作用

冠瘿碱是在冠瘿瘤内合成并分泌出来的，是农杆菌的碳源和氮源。大部分其他土壤微生物都不能利用冠瘿碱。Glu的二环糖衍生物。②毒性基因（vir）决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的转移，

进入和整合。vir的产物能诱导Ti质粒产生T-DNA区域的单链拷贝。单链拷贝从Ti质粒脱离后，可与vir的产物VIRD2蛋白结合，并在VIRD4和VIRB蛋白的帮助下穿过浓杆菌内膜、外膜、壁和植物细胞壁、细胞膜及核膜，最后整合到植物染色体上。单链的5’端是右边界区域，含有25bp重复序列，参与整合。章鱼碱代谢基因和胭脂碱代谢基因：

④不相容性基因控制Ti质粒的不相容性。③冠瘿碱代谢基因分别编码代谢这两种冠瘿碱的酶。维持农杆菌生长。（1）第一步:植物受伤植物受伤后能分泌酚类化合物（如乙酰丁香酮、

羟基乙酰丁香酮），诱导Ti质粒上的毒性基因表达。2.农杆菌的感染和生存（1）第二步

感染植物（3）第三步

毒性基因（vir）表达T-DNA上的产物催化产生过量的生长素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。脓杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常在茎的基部）。virA、virG、virD、virB（4）第四步T-DNA转移T-DNA被vir基因产物切下来，并运送到植物细胞核里，整合到植物基因组中。（5）第五步

诱导冠瘿瘤（6）第六步

土壤农杆菌代谢冠瘿碱。3.Ti质粒的种类根据所编码的冠瘿碱（opine），分为（1）章鱼碱（octopine)型质粒（3）农杆碱（agropine）型质粒（2）胭脂碱（nopaline）型质粒裸子植物、双子叶被子植物、禾谷类单子叶植物（玉米）。（1）能够自发地整合到植物的染色体上。（2）能转化多种植物。（3）强启动子4.Ti质粒转化的对象5.Ti质粒作为载体的可能性T-DNA的opine合成酶基因上有一个强启动子，能启动外源基因的表达。25（1）分子量太大（200kb）！（2）限制性酶切位点太多。（3）被转化的植物细胞成为肿瘤，不能

再分化。（4）在大肠杆菌中不能复制。6.天然Ti质粒作载体的缺点（4）冠瘿碱合成对于植物无意义。应剔除掉。（5）加入大肠杆菌的ori和选择标记。（6）加上真核生物的转录信号和结束信号以

及添加polyA的信号序列。（1）保留T-DNA的转移功能部分（vir基因，

左右边界）。（2）减少限制性酶切位点，引入单一插入位

点。（3）取消T-DNA的致瘤基因，使被转化的植

物细胞不再成为肿瘤，能正常分化。7.Ti质粒的改造改造后的Ti质粒载体模式leftrightMCSAMProriVirselect8.Ti载体的类型（1）共整合载体（cointegratevectors）最早获得广泛应用的Ti质粒是比利时科学家P.Zambrisky等1983年改造的pGV3850需要同源重组才能插入外源基因。①pGV3850的特点：是一种受体质粒，外源基因不能直接插入，而是需要借助于pBR322质粒作为中间载体。宿主土壤农杆菌的选择标记是位于中间载体pBR322上的卡那霉素抗性（Kanr）基因（编码氨基糖苷磷酸转移酶）。位于T-DNA右半部分的胭脂碱合成酶基因（nos）。1）农杆菌选择标记2）最终受体植物的选择标记②选择标记卡那霉素抗性（Kanr

）基因（卡那霉素对植物有剧毒！）③外源基因插入pGV3850的过程外源基因KanrpBR322土壤农杆菌含pGV3850