高效液相色谱-02

第七章

高效液相色谱分析法一、液-固吸附色谱liquid-solidadsorptionchromatograph二、液-液分配色谱liquid-liquidpartitionchromatograph三、离子交换色谱ion-exchange

chromatograph四、离子色谱ionchromatograph五、离子对色谱ion-pairchromatograph六、排阻色谱size-exclusionchromatograph七、亲和色谱(AC)Affinity

chromatograph第二节

主要分离类型与原理highperformanceliquidchromatographbasicprincipleandmainseparatingtypes2023/10/157.1HPLC的分类与基本原理7.1.1高效液相色谱法的分类化合物的极性、电荷、分子大小、旋光性四种主要的性质可以用来产生高效液相色谱分离。2023/10/15按固定相分类按分离机理分类液液色谱法LLC液固色谱法LSC分配色谱法吸附色谱法离子交换色谱法分子排阻色谱法化学键合色谱法亲合色谱法胶束色谱法HPLC

7.1高效液相色谱法的分类2023/10/15详细分类图1液－固吸附色谱法LSC

2液－液分配色谱法LLC3化学键合色谱法BPC4离子交换色谱法IEC5空间排阻色谱法SEC6亲合色谱法AC7胶束色谱法MC8手性色谱法CC9毛细管电泳色谱法CE正相～NLLC反相～RLLC正相～NBPC反相～RBPC一般～IEC离子色谱法IC氨基酸色谱法AA凝胶渗透色谱法GPC凝胶过滤色谱法GFC开管～OTCEC填充～PCEC一般～RBPC离子对色谱法PIC离子抑制色谱法ISC胶束～

MEKC壁处理～

CEC键合相～

CEC毛细管凝胶～

CGEHPLC2023/10/157.3各类高效液相色谱法>>

7.3.1吸附色谱法LSC1.分离机理吸附色谱法是被分离的组分分子(溶质分子)与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心，因溶质分子的吸附系数的差别而分离。2.影响容量因子(k)的因素以硅胶吸附剂为例：⑴硅胶与溶质分子的亲和力顺序：k大者后出峰。kmin→饱和烃＜芳烃＜…＜酯醛酮＜…＜羧酸→kmax⑵溶质的极性：常用流动相是以烷烃为底剂，加入适当的极性溶剂组成二元或多元溶剂系统，从而能调整溶解的极性，控制组分的保留时间。溶剂系统的极性越大，洗脱力越强。2023/10/15液-固吸附色谱

liquid-solidadsorptionchromatography

固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；

流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。

基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；

缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；2023/10/157.3各类高效液相色谱法>>

7.3.2分配色谱法(LLC)1.分离机理：分配色谱法是由于样品组分溶入固定相(s)与流动相(m)达到“平衡”后的分配系数的差别而分离。组分在固定相与流动相中的溶解度差别越大(K、k差别也大)分离效果越好。2.正相液－液色谱法(NLLC)：流动相极性小于固定相极性的LLC称为NLLC。正相洗脱时样品中极性小的组分先流出色谱柱，极性大的组分后流出色谱柱.3.反相液－液色谱法(RLLC)：流动相极性大于固定相极性的LLC称为RLLC。反相洗脱时样品中极性大的组分先流出色谱柱，极性小的组分后流出色谱柱.2023/10/15液-液分配色谱

liquid-liquidpartitionchromatography固定相与流动相均为液体（互不相溶）；

基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；

流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相

normalphase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相

reversephase）。正相与反相的出峰顺序相反；

固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；

化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。2023/10/157.3.3离子交换色谱

ion-exchangechromatography

固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；

流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；

基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；阳离子交换：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

阴离子交换：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-

应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。2023/10/157.3.4离子色谱

ionchromatography

离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一中技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。

2023/10/157.3.5排阻色谱色谱

size-exclusionchromatography

固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离2023/10/157.3.6亲和色谱(AC)

Affinitychromatograph

原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。

先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。2023/10/157.3.7化学键合色谱法化学键合相：将具有官能团的固定相键合到载体表面，构成化学键合相。化学键合色谱法：以化学键合相为固定相的色谱法，简称键合色谱法(bondphasechromtography)。特点：既有分配作用，又有吸附性能。硅胶表面十八烷基硅烷键合相ODS2023/10/15反相键合相色谱法，RBPC正相键合色谱法，NBPC离子对色谱法，IPCor.PIC

离子抑制色谱法，ISC其他色谱法

7.3.7化学键合色谱法

2023/10/15反相键合相色谱法RBPC典型的反相键合色谱法(RBPC)，是用非极性的键合固定相和极性流动相组成的色谱体系。固定相常用十八烷基硅烷键合相(ODS或C18)；流动相常用甲醇－水、乙腈－水。非典型反相键合色谱系统，用弱极性或中等极性键合相与极性大于固定相的流动相组成。

7.3.7化学键合色谱法>>1.反相键合相色谱法

2023/10/15

7.3.7化学键合色谱法>>1.反相键合相色谱法⑴分离机理反相键合相表面具有非极性烷基官能团和未被取代的硅醇级，分离机理较复杂，有疏溶剂理论、双保留机理、顶替吸附－液相相互作用模型等。疏溶剂理论：把非极性的烷基键合相看作一层键合在硅胶表面上的十八烷基的“分子毛”，它有较强的疏水特性。如图10-4所示。图10-4疏水剂缔合示意图2023/10/15

7.3.7化学键合色谱法>>1.反相键合相色谱法当用极性溶剂为流动相来分离含有极性官能团的有机化合物时，一方面分子中的非极性部分与固定相表面上的疏水烷基产生缔合作用，使它保留在固定相中；另方面被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，促使它离开固定相，并减小其保留作用。结果两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。图20-4疏水剂缔合示意图2023/10/15

7.3.7化学键合色谱法>>1.反相键合相色谱法

⑵流动相的极性与容量因子的关系流动相极性增大，洗脱能力降低，溶质的k增大，tR增大；反之，k减小，tR也减小。作反相洗脱时，对于结构相近的组分，极性大的组分先出峰。2023/10/15正相键合色谱法(NBPC)：固定相一般以氰基或氨基等极性基团作为键合相；流动相以烷烃(正己烷)中加入适量的极性调整剂(如氯仿、甲醇、乙腈等)为流动相。用途主要用于分离极性不同的化合物、异构体，特别适用于分离不同类型的化合物。⑴分离机理主要靠组分分子与固定相之间的范德华力、氢键作用力的差别而进行分离。⑵流动相的极性与容量因子的关系作正相洗脱时，流动相的极性增大，洗脱能力增加，k减小，tR减小；反之，k与tR增大。分离结构相近的组分时，极性大的组分后出峰。7.3.7化学键合色谱法>>2.正相键合色谱法2023/10/15

7.3.7化学键合色谱法>>3.离子对色谱法⑵分离机理

以RPIC分离碱类物质为例，用离子对模式说明分离机理⑶分配系数⑷主要用途有机酸碱盐的分离，避免流动相(酸碱)对泵和流路的腐蚀；药物分析，如生物碱、有机酸、磺胺类药物、某些抗生素和维生素，体内药物分析等。缺点是价格昂贵。固定相流动相2023/10/15在反相色谱法中，通过调节流动相的pH值，抑制样品组分的解离，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸、弱碱的目的，这种技术称为离子抑制色谱法。⑴适用范围适用于3.0≤pKa≤7.0弱酸；7.0≤pKa≤8.0弱碱。⑵抑制剂流动相中加入少量的弱酸、弱碱或缓冲溶液为抑制剂(常用乙酸、氨水、磷酸盐、乙酸盐)。

7.3.7化学键合色谱法>>4.离子抑制色谱法2023/10/15⑶影响容量因子的因素对于弱酸，当流动相pH＜pKa时，组分以分子形式为主，k值增大，tR增大；反之，组分以离子形式为主，k值变小，tR减小。对于弱碱，以上两种情况正好相反。⑷用途可用于有机弱酸、弱碱与两性化合物的分离，以及它们与分子型化合物共存时的分离。不适用于pKa＜3的酸、pKa＞8的碱，这些可采用离子对色谱法、离子交换色谱法进行分离。

7.3.7化学键合色谱法>>4.离子抑制色谱法2023/10/15

7.3.8其他色谱法(阅读)手性色谱法环糊精色谱法胶束色谱法亲和色谱2023/10/15概念：高效液相色谱法(HPLC)是在20世纪60年代末，以经典液相色谱为基础，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高效固定相、高压输液系统和高灵敏度的在线检测器，从而发展起来的一种新型分离分析技术。随着科学和技术的不断改进与发展，目前已成为应用极为重要、广泛的分离分析手段.特点：分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动化。7.4对比>>

2023/10/15

HLPC与经典液相色谱和气相的比较4.23高效液相色谱与经典液相色谱比较2023/10/15高效液相色谱与气相色谱比较2023/10/