贝那普利及其活性代谢物贝那普利拉的衍生化LCMS同时测定

人血浆中贝那普利及其活性代谢物贝那普利拉的衍生化LC/MS同时测定法及其药代动力学特征

姓名：简龙海

导师：丁黎吴如金

方法特点

（1）通过对贝那普利及其活性代谢物贝那普利拉进行甲酯化，首次建立了衍生化LC/MS法快速、灵敏地同时测定两者的血药浓度；（2）首次研究了贝那普利及其活性代谢物贝那普利拉在国人体内的药代动力学。

第一部分

盐酸贝那普利是第一个可用于治疗肝、肾功能不全高血压患者的血管紧张素转化酶抑制剂。1990年3月首次在丹麦上市，1999年国家药品监督管理局批准北京诺华制药有限公司生产上市，商品名为洛汀新。

文献报道贝那普利口服后吸收迅速，消除快，其在体内经肝脏水解生成有活性的二元羧酸代谢物——贝那普利拉，代谢过程见下图。

代谢活性是贝那普利的1000倍据文献报道，贝那普利（Ⅰ）和贝那普利拉（Ⅱ）都能够与血管紧张素转化酶竞争性结合，使全身外周血管舒张，降低血管阻力而产生降压作用，因此，同时测定贝那普利和贝那普利拉的血药浓度，对研究两者的药代动力学具有较高的参考价值。目前对于Ⅰ和Ⅱ血药浓度的测定方法已有文献报道：GC/MS法同时测定血浆中Ⅰ和Ⅱ的浓度，但样品需要衍生化以帮助气化，而且血浆处理需要经过一步固相萃取、两步液-液萃取，操作繁琐、耗时，不利于大批量生物样品的分析。另外，固相萃取的回收率低，Ⅰ和Ⅱ分别为30.5%、62.4%。目前LC/MS联用技术作为一种新型分离分析技术，在体内药物分析中正发挥着独特的作用。对于Ⅰ和Ⅱ，目前未见到有文献报道以LC/MS法同时测定其血药浓度。于是我们希望建立LC/MS法同时测定Ⅰ和Ⅱ的血药浓度。但从Ⅰ和Ⅱ的化学结构式和条件的预摸索发现，如果Ⅰ和Ⅱ未经任何化学结构修饰而直接以LC/MS法同时测定其血药浓度，那么我们将会遇到以下三个问题：1、Ⅱ含有2个羧基，极性强，难以用液-液萃取法提取出来；而以固相萃取法处理血浆时，不但回收率不高，而且操作繁琐、耗时；以蛋白沉淀方法处理血浆时，血浆中内源性物质干扰其测定；3、Ⅱ以LC/MS法测定时灵敏度不高，达不到该药的药代动力学灵敏度要求，而Ⅰ的灵敏度较高。

2、Ⅰ的分子结构比Ⅱ的分子结构多1个乙基，少1个羧基，结果Ⅰ和Ⅱ在色谱柱上的保留相差太大，不利于同时测定；仔细研究Ⅰ和Ⅱ的化学结构式发现，羧基和酯基导致了Ⅰ和Ⅱ在色谱保留和质谱响应上均具有较大的差别，所以需要对羧基进行酯化结构修饰，其中甲酯化是个较理想的方法，因为其有以下四个优点：（1）Ⅰ和Ⅱ甲酯化后，两个衍生物化学结构式之间只相差一个亚甲基，极性相近，有利于同时测定；

（2）Ⅰ和Ⅱ甲酯化后，有利于样品的离子化，从而提高灵敏度；（4）Ⅱ甲酯化后，脂溶性增强，一方面易被非极性有机溶剂提取出来，另一方面增强了色谱保留，从而有利于避开血浆中极性物质的干扰。（3）Ⅰ和Ⅱ甲酯化缩短了两者在色谱柱上的保留差距，这样可通过加大流动相中甲醇的含量以缩短分析时间；另外流动相中水相含量的减少有利于流动相的去溶剂化，从而提高灵敏度；衍生化

衍生化试剂选择

衍生化试剂的制备

衍生化反应

衍生化产物的确证

衍生化产物的色谱保留和灵敏度

小结衍生化试剂选择

羧基化合物的甲酯化试剂可采用甲醇制盐酸(硫酸）溶液或重氮甲烷乙醚溶液。甲醇制盐酸(硫酸）溶液的反应时间长，不适于微量合成。重氮甲烷活性强，反应产率高，几乎可达100％，反应时间短，对一元酸、二元酸均能有效甲酯化，可用于微量合成，很适合于血浆中Ⅰ和Ⅱ的甲酯化。衍生化试剂重氮甲烷的制备

CH3NH2·HCl+H2NCONH2加NaNO2常温，浓KOHCH3N(NO)CONH2CH2N2(重氮甲烷)+KNCO+2H2O煮沸回流3h冷却至室温冷至0℃缓缓导入冰－硫酸混合物中温度不升过0℃泡沫沉淀甲酯化反应

R-COOH+CH2N2室温R-COOCH3+N2↑反应方程式如下：I.S.IDIIIDIIDI.S.甲酯化产物的确证[M+H]+

[M+Na]+

[M+K]+

[M+H]+

[M+Na]+

[M+H]+[M+Na]+[M+H]+[M+Na]+[M+H]+

[M+Na]+

[M+H]+

[M+Na]+

另外，还对衍生化前后主要碎片离子进行比较，结果表明甲酯化反应是成功的。

甲酯化衍生物的色谱保留和灵敏度30倍于II的响应4倍于I的响应I.S.I.S.IDIIIDII小结甲酯化反应是成功的。甲酯化方法能很好地解决Ⅰ、Ⅱ的同时测定、灵敏度等问题条件的选择

Fragmentor电压

血浆处理方法

血浆样品的酸碱度

衍生化反应时间

流动相水相的pH值

水相中醋酸铵的浓度

小结Fragmentor电压的选择由于质谱仪上的Fragmentor电压会影响到样品在质谱仪上的碰撞诱导解离（CID）效果，从而影响样品各种离子的响应，所以需要选择一个合适的Fragmentor电压和合适的离子，使待测物在质谱仪上有最高的响应。我们在Fragmentor电压分别为50~150V时测定同一个样品。结果以峰面积计得Ⅰ和Ⅱ各自衍生物的[M+H]+离子在电压为100V时响应最高，故选择100V测定样品。

Ⅰ和Ⅱ极性强，以常规的液-液萃取法处理时回收率极低，而以固相萃取法处理血浆时，文献报道回收率不高，而且操作繁琐、耗时。为了快速、简便地进行血浆样品前处理，我们先是将血浆样品直接与重氮甲烷-乙醚溶液反应、萃取，但结果回收率低、重现性差，原因可能是含有大量羧酸的血浆中蛋白质干扰了Ⅰ和Ⅱ与重氮甲烷的反应。于是我们将血浆去除蛋白后，再进行衍生化反应。

血浆处理方法的选择

然而，去除蛋白的血浆上清液由于含有水，难以全部吹干，而且即使全部吹干，所得的回收率也很低（小于50%）。于是我们只吹去大部分较易吹干的有机层，只剩余约0.5ml难于吹干的水层，再与重氮甲烷-乙醚溶液进行反应。结果回收率得到了提高，重现性也满足生物样本分析要求。由于蛋白沉淀试剂不同，空白血浆的干扰情况、样品的回收率都会不同，所以需要选择一个适当的蛋白沉淀试剂。三种血浆处理方法均无内源性物质干扰样品的测定，而且以乙醇处理的样品响应最高。血浆样品酸碱度的选择

以乙醇沉淀蛋白时，上清液的pH为9～10。在这个pH范围内，Ⅰ、Ⅱ及内标三者的羧基会部分解离成阴离子状态，从而不利于它们的衍生化。于是我们对血浆样