第一实验：酵母双杂交Yeast TwoHybrid

第一实验：酵母双杂交（YeastTwo-Hybrid）目的掌握酵母双杂交原理和方法。利用酵母双杂交方法在拟南芥转录因子AP2-EREBP家族中筛选与拟南芥Med25有相互作用的蛋白。原理酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生物转录因子，如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域:DNA结合结构域(DNA-bindingdomain，DBD)和转录激活结构域(transcription-activatingdomain，AD)。DNA结合结构域可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域可在其连接区适当部位断开，仍具有各自的功能。将两个待测蛋白分别与这两个结构域组成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与DBD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。图SEQ图表\*ARABIC1-1酵母双杂交基本原理酵母双杂交系统在发展中增添了接合型酵母双杂交和反向酵母双杂交系统。其中接合型双杂交系统就是已预先将文库转化了某个接合型的单倍体酵母，然后再和转化了诱饵质粒的相反接合型的单倍体进行接合，形成二倍体，并检测报告基因的表达。酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与DBD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。(2)与AD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称靶蛋白(prey)。(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株则具有相应的缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。酵母双杂交系统常应用在：(1)研究两个已知蛋白是否存在相互作用，同一蛋白是否有自身相互作用以及相互作用的分子区域。(2)用已知功能的蛋白做诱饵，在cDNA文库中寻找有相互作用的未知蛋白，以获取蛋白质相互作用的网络途径信息。(3)以功能未知的新蛋白去筛选文库，根据选到的靶蛋白的已知功能来推测该新蛋白的功能。(4)建立蛋白质相互作用的图谱。使用酵母双杂交系统应注意如下问题：(1)在筛选文库之前，要检测诱饵质粒转化后表达的诱饵蛋白本身能否激活报告基因。(2)由于诱饵蛋白的存在致使报告基因His产生渗漏表达（leaky）。一般情况下，在培养基中加入3-AT（3-amino-1,2,4-triazole）可以有效地抑止His报告基因的渗漏表达。(3)在完成筛选之后，需检测猎物蛋白是否自激活。一个完整的利用酵母双杂交筛选相互作用蛋白的实验包括cDNA文库的构建，诱饵基因载体构建，载体转化酵母，报告基因渗漏表达滴定，酵母接合实验，报告基因表型的测定，诱饵蛋白与靶蛋白相互作用复验。本实验只完成酵母接合实验，报告基因表型的测定。在本实验中，pDEST32质粒携带诱饵蛋白MED25，营养标记基因是Leu2，转化到酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）AH109（Mata，trp1-901，leu2-3，112，ura3-52，his3-200，gal4△，gal80△，LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3，GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2，URA3::MEL1UAS-MEL1TATA-lacZ，MEL1）菌株中；pDEST22质粒携带的靶蛋白文库来自拟南芥转录因子，营养标记基因是Trp1，转化到酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）Y187（MATαura3-52,his3-200,ade2-101,trp1-901,leu2-3,112,gal4Δ,met–,gal80Δ,MEL1,URA3::GAL1UAS-

GAL1TATA-lacZ）菌株中。报告基因使用HIS3。诱饵载体和猎物载体的启动子都是酵母组成型强启动子ADH。其中，拟南芥转录因子库是组分特异的库（specificlibraries），相对传统全cDNA库而言，它不受组分的组织表达特异性、发育阶段特异性以及表达量低的影响，提高了筛选效率。该库由1000多个独立的克隆组成，筛选后不需测序。图1-SEQ图表\*ARABIC2实验材料示意材料、试剂、仪器材料酵母菌株AH109含有pDEST32-bait质粒(Leu)酵母菌株Y187（Matα）含有pDEST22-prey质粒(Trp)，共有4个不同基因酵母菌株Y187（Matα）含有pDEST22空质粒(Trp)试剂液体YPAD培养基30ml液体SD-Trp培养基30ml液体SD-Leu培养基5ml固体SD-Trp-Leu培养基30ml固体体SD-Trp-Leu-His培养基30ml灭菌水30ml如上培养基需121℃灭菌15分钟。仪器30℃的恒温摇床，30℃的恒温培养箱，电子天平，pH计；量筒（10ml，100ml），烧杯（50ml，100ml），玻璃棒，1000ul移液器,200ul移液器,20ul移液器。灭菌的1000ul、200ul吸头，灭菌的10ml试管，灭菌的1.5ml离心管，灭菌平皿。操作实验准备灭菌：各种培养基，蒸馏水约30ml，10ml试管约10支，1.5ml离心管约20个，200ul和1000ul吸头各半盒。培养酵母挑酵母AH109（pDEST32-Med25）单菌落，以3mlSD-Leu培养基培养过夜。培养条件：30℃，200rpm。选含有拟南芥转录因子AP2-EREBP家族的3个基因的酵母Y187（pDEST22-TF）单菌落，分别以3mlSD-Trp培养基培养过夜。培养条件：30℃，200rpm。挑酵母Y187（pDEST22空载体）单菌落，以3mlSD-Trp培养基培养过夜。培养条件：30℃，200rpm。图1-SEQ图表\*ARABIC3基本实验流程酵母接合在4个新试管中分别加入2.8mlYPAD培养基，各加100ul诱饵蛋白的菌液，再分别加入100ul各靶蛋白及对照的菌液，混匀，30℃，200rpm培养16-24小时。在筛选培养基上培养接合后的酵母取酵母菌液，用灭菌水稀释到1/10，点到筛选培养基SD-Trp-Leu和SD-Trp-Leu-His平板上，每个点5ul。观察实验结果第二周周一观察实验结果，做实验记录，并给老师登记，清理用过的平皿。注意事项注意无菌操作。菌株与培养基要匹配注意培养基不可相互污染。实验提示如果诱饵质粒转化后表达的诱饵蛋白本身能激活报告基因，可以用什么方法继续寻找与之相互作用的蛋白？附录=1\*ROMANIYPAD培养基（改良完全培养基，用于酵母常规培养）YeastExtract10gTryptone20gGlucose20gAdenineSulfate100mgAutoclaved,distilledH2O定容1liter用HCl调pH到6.0，121°C灭菌15分钟。SD-Trp培养基（缺陷型培养基syntheticdrop-out）YNB（Yeastnitrogenbase）6.7gSD-Trp0.74gGlucose20g2MNaOH1000ulAutoclaved,distilledH2O定容1literSD-Leu培养基YNB（Yeastnitrogenbase）6.7gSD-Leu0.69gGlucose20g2MNaOH1000ulAgar20gAutoclaved,distilledH2O定容1literSD-Trp-Leu培养基YNB（Yeastnitrogenbase）6.7gSD-Trp-Leu0.64gGlucose20g2MNaOH1000ulAgar20gAutoclaved,distilledH2O定容1literSD-Trp-Leu-His培养基YNB（Yeastnitrogenbase）6.7gSD-Trp-Leu-His0.62gGlucose20g2MNaOH1000ulAgar20gAutoclaved,distilledH2O定容1liter附录=2\*ROMANII参考书目：Ou,B.,etal.(2011).AHigh-ThroughputScreeningSystemforArabidopsisTranscriptionFactorsandItsApplicationtoMed25-DependentTranscriptionalRegulation.MolecularPlant1–10Riechmann,J.L.,etal.(2000).Arabidopsistranscriptionfactors:genome-widecomparativeanalysisamongeukaryotes.Science.290,2105–2110.Fields,S.,andSong,O.-k(1989).Anovelgeneticsystemtodetectprotein–proteininteractions.Nature.340,245–246附录=3\*ROMANIII酵母转化（简化版，非正规）材料AH109酵母，pDSET32-Med25质粒。试剂YPAD液体培养基，SD-Leu固体培养基，灭菌水，PEG/LiAc悬菌液300ulPEG/LiAc悬菌液：30ul10*TE(pH7.5)30ul10*LiAc240ul50%PEG3350(母液皆过滤除菌)仪器灭菌的1000ul、200ul吸头，灭菌的10ml试管，灭菌的1.5ml离心管，灭菌平皿。方法挑酵母AH109单菌落，以3mlYPAD30℃培养过夜。5000rpm离心3分钟，收集菌体，以1-2ml灭菌水重悬。再次5000rpm离心3分钟，收集菌体。以300ulPEG/LiAc溶液重悬酵母。50ng质粒加到50ul菌液中，42℃水浴1小时，每20分钟震荡一次。冰置2-3分钟，最大转速离心5秒，弃上清。100ul灭菌水重悬菌体，铺到合适的固体培养基上。30℃培养2-4天。

第二实验：DNA的Southern分析DNA的Southern分析是1975年由E.M.Southern建立的DNA杂交方法。本实验经琼脂糖凝胶电泳将DNA分离后，通过毛细管作用，把凝胶中的DNA转移到固相支持膜上，用放射性或荧光等物质标记的单链DNA或RNA探针与固定于膜上的DNA杂交，经放射自显影或显色等方法确定与探针互补的电泳条带的位置。实验目的熟悉DNA印迹技术；学习用地高辛（Dig）标记的探针检测目的DNA的方法；用地高辛（Dig）-dNTP标记SSG基因的400bp的DNA片段，检测pBS-SSG的基因DNA。实验原理DNA通过琼脂糖凝胶电泳分离后，使用变性液使DNA在原位发生变性（双链DNA分解为单链DNA），再通过毛细管作用、电转移或真空转移把凝胶中的DNA转移到一固相支持膜上，如硝酸纤维素膜或尼龙膜，DNA片段在转移到固相支持膜的过程中，其相对位置保持不变，用放射性或荧光等标记的单链DNA或RNA与固定于膜上的DNA杂交，使具有同源序列的两条单链DNA复性，经放射自显影或显色等方法确定与探针互补的电泳条带的位置。用尼龙膜代替硝酸纤维素膜的优点是，尼龙膜易于处理，对DNA结合效率高而且牢固，特别是在低离子强度的缓冲液中对于低分子量（50bp）的核酸仍有较强的结合能力，另外同一张膜可用不同探针进行多次杂交。实验材料与试剂实验材料：电泳设备、尼龙膜、恒温水浴锅、电子天平、pH计、杂交仪、80℃烘箱、100℃水浴锅、小摇床、微量移液器、吸头（1000μl、200μl）、1.5ml离心管、量筒、烧杯、玻璃棒、大平皿（直径15cm）、小平皿（直径9cm）、20cm×15cm玻璃板、纸巾、滤纸、500g重物。Dig标记SSG基因的400bp的DNA片段作为探针，pBS-SSG作为检测样品，pBS空载体作为阴性对照。试剂：琼脂糖：选用高质量的琼脂糖，使DNA转膜时凝胶不会被压碎。1×TAE1000ml：Tris4.84g,冰醋酸1.14ml,EDTA0.29g,定容，pH8.0变性缓冲液30ml.：0.5mol/LNaOH，1.5mol/LNaCl.中和缓冲液30ml.：0.5mol/LTris.Cl,3mol/LNaCl,pH7.520×SSC300ml：3mol/LNaCl,0.3mol/L柠檬酸钠，pH7.0.2×洗膜缓冲液：2×SSC，0.1%SDS.0.1×洗膜缓冲液：0.1×SSC，0.1%SDS.10×封闭剂：Roche产品，用显色缓冲液Ⅰ配成10%（W/V）,加热助溶，但不能煮沸。显色缓冲液Ⅰ50ml：0.1mol/L马来酸，0.15mol/LNaCl，pH7.5显色缓冲液Ⅱ10ml：用时现配，9ml显色缓冲液Ⅰ和1ml10×封闭液混匀。显色缓冲液Ⅲ20ml：0.1mol/LTris.Cl,0.1mol/LNaCl,pH9.5碱性磷酸酶偶联的地高辛抗体（Anti-Dig-Ap）NBT/BCIP显色液实验步骤DNA电泳和转膜用1×TAE缓冲液配制0.8%的琼脂糖凝胶，然后向电泳槽内加入1×TAE缓冲液。上样后用50~70V电压进行电泳，当溴酚蓝距胶边缘2cm左右时停止。电泳结束后，戴上手套取出胶，切掉一角作为标记。在小培养皿中，用灭菌双蒸水洗凝胶5min。凝胶浸泡在20ml变性缓冲液中15min，期间缓缓轻摇。灭菌双蒸水洗凝胶2次，每次5min.凝