第二十一章 常用分子生物学技术的原理及应用

第二十一章常用分子生物学技术的原理及应用ThePopularTechnologyinMolecularBiology:PrincipleandApplication第一节

分子杂交与印迹技术

MolecularHybridization&BlottingTechnology分子杂交特性（见第二章）探针技术印迹技术核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)利用DNA变性与复性这一基本性质来进行DNA或RNA定性或定量分析的一种技术。一、分子杂交与印迹技术的原理第二节聚合酶链反应

PolymeraseChainReaction（PCR）一种可以将目的微量的DNA片断扩增100万倍以上的技术(末代沙皇尼古拉二世、1918年的流行性感冒病毒、电影《侏罗纪公园》，以及辛普森杀妻案，这四件事情到底有什么相关？答案是没有)PCR可以把指定的基因片段

数量放大百万倍染色体Mullis(1993)一、基本工作原理以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板3’和5’端相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制延模板链延伸直至完成新的DNA合成。重复这一过程，可使目的DNA片段得以扩增。（一）PCR体系基本组成成分含Mg2+的缓冲液dNTPs耐热DNA聚合酶TagDNA聚合酶特异性引物一对分别与待扩增DNA序列两端互补的寡核苷酸片段。模板DNA（二）PCR基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C循环25~30次使模板DNA完全变性成单链。同时引物自身和引物之间存在的局部双链得以消除使引物和模板DNA退火结合此温度下DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA链的延长三个步骤为一个循环，每次循环产物作为下一轮模板进入下一轮循环第一轮循环5/3/3/5/5/5/5/5/引物A引物B变性（95℃）6075859590807065555045403530℃退火（60℃）延伸（72℃）DNA-PolDNA-Pol温度第二轮循环5/5/5/3/3/5/5/5/引物A引物B6075859590807065555045403530℃变性（95℃）退火（60℃）延伸（72℃）5/5/5/5/温度DNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-Pol第三次循环5/5/5/5/5/5/5/6075859590807065555045403530℃5/变性（95℃）退火（60℃）延伸（72℃）温度DNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-Pol基因组DNADNA样品第一次循环第二次循环第三次循环第四次循环待扩增序列引物A引物B3/5/3/5/5/3/5/3/四、PCR的主要用途PCR的用途基因突变分析基因的体外突变目的基因的克隆DNA序列测定DNA和RNA的微量分析1、与反转录结合，直接从组织细胞中的mRNA获得目的基因；2、利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得目的基因片段；3、利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得具有一定序列相似性的基因片段；4、利用随机引物从cDNA文库中克隆基因。利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的DNA的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。PCR技术高度敏感，对DNA的含量要求很低。理论上只要存在一分子的模板就可以获得目的片段。RNA需要反转录。利用PCR结合其它技术，可以提高基因突变检测的敏感性。三、几种重要的PCR衍生技术（一）反转录PCR技术（二）原位PCR技术（三）实时PCR技术第三节核酸序列分析

NucleicAci