缺氧诱导因子-1在大鼠血栓闭塞性脉管炎模型中的表达及意义

缺氧诱导因子-1在大鼠血栓闭塞性脉管炎模型中的表达及意义

动脉硬化性锁静脉炎（tao）是常见的出血性缺血性疾病之一，主要表现为全身非感染性动脉炎。本课题旨在研究缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在大鼠血栓闭塞性脉管炎模型中的表达规律并探讨其临床意义。1材料和方法1.1氧基双环因子水分酶系统成分酶Wistar大鼠35只,雄性,体重400g～550g,山西医科大学生理教研室提供;月桂酸,北京市旭东化工厂;缺氧诱导因子-1α酶联免疫试剂盒,上海西塘生物科技有限公司。缺氧诱导因子-1α免疫组化试剂盒,武汉博士德公司。1.2方法1.2.1大鼠血栓闭塞性脉管炎模型的制备Wister大鼠35只,随机分为假手术组及1d、3d、1周、2周、3周、4周造模组,每组5只。术前均留取血清标本,参照文献方法稍加改进,制作大鼠血栓闭塞性脉管炎模型。术毕给予青霉素40×104U腹腔注射,预防感染。按照造模时间分批处死,假手术组于4周时处死,处死前留取术后血清标本,并取左右后肢造模处周围肌肉组织。1.2.2血清hif-1检测采用ELISA法检测术前与术后血清中缺氧诱导因子-1α浓度,按照试剂盒说明书进行。1.2.3小鼠骨髓中he免疫组化SABC法检测各组造模侧肢体血管及肌肉组织中缺氧诱导因子-1α的表达情况,健侧肢体作为对照,操作按照试剂盒说明书进行。HIF-1α蛋白以细胞核或胞浆中有棕黄色颗粒为阳性,无反应为阴性,在400倍视野下采用CooledCCD采集图像,使用IPP软件测量表达平均灰度值。平均灰度值范围0～255,其值越低,蛋白表达越高,其值越高,蛋白表达越低。1.3统计处理计量资料以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示。采用方差分析,两两比较采用LSD法。SPSS13.0处理分析。2结果2.1周、3周、4周组各造模组大鼠均出现左后肢缺血表现,依造模时间增加而逐渐加重,1d组、3d组均有左后肢缺血、肿胀、足趾发黑表现。1周组缺血表现加重、坏死范围扩大至踝部。2周组出现干性坏疽、坏死范围至膝部,局部炎症反应明显,3周、4周组有坏死肢体脱落表现,严重者有肢体干性坏疽,甚至肢体脱落。组织病理切片示:炎症反应明显,炎症细胞聚集,肌肉组织失去正常纹理结构,2周、3周、4周组股动脉内可见节段性闭塞,广泛血管内血栓形成,并伴有大量新生毛细血管。大鼠体征变化及病理切片结果证实,大鼠血栓闭塞性脉管炎模型建立成功。2.2造模前后血清中hof-1表达水平比较所有造模组大鼠术后血清HIF-1α表达均高于术前,造模1d组、3d组、1周组、2周组、3周组、4周组、术后血清HIF-1α表达水平分别与术前比较有统计学意义(P<0.05),假手术组造模前后HIF-1α血清表达水平比较无统计学意义,各造模组术后血清HIF-1α表达在1d组迅速升高,3d时略降低,后逐渐下降,但均高于假手术组水平,其中1d与3d之间、1周与2周之间、3周与4周之间比较无统计学意义,其余造模组间比较有统计学意义(P<0.05)。详见图1。2.3平均粒度值比较HIF-1α蛋白在假手术组双侧及造模组健侧肌肉中低表达,造模组患侧肌肉组织中高表达,各造模组患侧HIF-1α蛋白表达的平均灰度值较健侧均有统计学意义(P<0.05),其中1d组、3d组平均灰度值最低,两组间比较无统计学意义,较其他造模组比较有统计学意义(P<0.05),1周组、2周组表达水平组间比较无统计学意义,较其他造模组有统计学意义(P<0.05),3周组、4周组间比较无统计学意义,较其他造模组有统计学意义(P<0.05)。详见图2。3血管造影在血管生理和临床应用中的应用TAO是一种以中小动脉节段性、非化脓性炎症和腔内血栓形成特征的疾病,是青壮年肢体缺血的主要原因之一,其发病特点、病理变化和临床特点均有别于动脉粥样硬化和其他免疫性动脉炎,但组织的缺血缺氧是其发病机制中最重要的一环。缺氧诱导因子-1α作为目前发现的唯一在低氧条件下发挥作用的调控亚基,可促进多种血管生成因子的表达,促进生理及病理性血管的生成,组织缺血再灌注损伤中发挥重要作用。本实验通过建立大鼠TAO模型,初步探讨HIF-1α在其发病过程中的表达规律,以期为临床诊断治疗提供简便有效的量化指标。TAO动物模型的复制和研究是本研究的关键环节与基础。TAO动物模型制作方法最早报道是Ashida采用向大鼠股动脉注射月桂酸钠的方法。本实验发现,注射后严格压迫穿刺点,确认无出血之后即可缝合皮肤,无需OB胶封闭穿刺点,预实验及正式试验中均未发现实验动物造模肢体出血及死亡现象,此为本实验的改进之处。Tarak等认为,肢体对动脉阻塞作出适应性反应中,最重要的是动脉生成中,侧支循环重建和血管内血流量增加。本研究证实,大鼠血栓闭塞性脉管炎模型中,缺血早期HIF-1α在血清和肌肉组织中均迅速升高,随着病情的进展而逐渐降低,一周后表达水平与早期已有统计学意义,但仍高于正常,此时组织中可见新生毛细血管生成,侧支循环建立,3周后血清中表达水平与正常水平已无差异,而肌肉组织中仍高于正常水平,但较早期已明显降低。缺血早期低氧浓度促使HIF-1α高表达,促进了多种血管生成因子的表达,有利于早期小血管生成以适应缺血缺氧环境,但其中很多是病理性小血管,并伴有血栓形成,对改善组织供氧意义不大,但后期其表达持续降低,导致了VEGF等生成减少,未能生成大量有效的侧支循环,导致病情加重,最终组织大量坏死,导致干性坏疽甚至肢体脱落。本实验中3d与一周之间的HIF-1α下降关键时间点及促使其降低表达的原因还有待进一步实验研究。目前对于TAO患者的术前诊断和手术效果评价,血管造影仍是“金标准”,但存在有创、价格不菲、不及时等缺点。本实验揭示的HIF-1α表达水平变化与病情变化相关性可将其作为术前诊断及术后监测、疗效评判的简便易行的方法之一,同时,相