加减清营汤对h

加减清营汤对h

动脉硬化性疾病（tao）是一种慢性闭塞病，以中、小动脉、静脉节段性、无菌性炎症和血管腔内血栓形成为特征的。目前尚不清楚病因和发病机制以及吸烟是公认的主要原因。加减清营汤对TAO的临床疗效已得到证实,动物实验亦已发现加减清营汤能够活血化瘀并改善机体的免疫状态。本实验采用体外细胞培养方法,用H2O2诱导血管内皮细胞损伤模型,加减清营汤用血清药理学方法给药,通过Western印迹法检测VEGF的表达水平,研究加减清营汤对血管再通、再生、阻止细胞凋亡及细胞保护作用的影响。1实验材料1.1药物、试剂和仪器人脐静脉血管内皮细胞株(ECV304):购自中国科学院上海生物化学研究所,中国科学院典型培养物保藏委员会。加减清营汤:在清代温病学家吴鞠通的清营汤的基础上结合王灿晖教授治疗脉管炎的经验组合成方,全方由丹参、赤芍、生地、麦冬、连翘、毛冬青等组成,制成100%煎剂(即1mL/1g生药),药物由本校国医堂门诊部药房提供,符合2005版《中华人民共和国药典》要求。丹参注射液:江苏神龙药业有限公司生产,批号:0506143;RPIM-1640培养粉:GIBCO,USA,批号:2535081;小牛血清:杭州四季青公司;胰蛋白酶:美国Amerso公司,批号:0428S05;二甲基亚砜:上海凌峰化学试剂有限公司,批号:050718;30%过氧化氢:分析纯,上海久忆化学试剂有限公司,批号20060910;NP40、脱氧胆酸盐、Tween20、苯甲基磺酰氟(PMSF),美国Sigma公司;VEGF多克隆抗体,北京博奥森公司;辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG,武汉博士德公司;NC膜,美国Millipore公司;Whatman滤纸;其他试剂均为国产分析纯。1.2动物SD雄性大鼠8只,体重(280±20)g,南京医科大学实验动物中心购买,合格证号:SCXK(苏2002-0031)。1.3置相显微观察5%CO2培养箱(NAPCO,USA);倒置相差显微镜(Olympus,Japan);DYY-6B型转移电泳仪、DYY-7B型稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂)。2实验方法2.1去血、除菌、除菌加减清营汤水煎剂给大鼠连续灌胃3天,每天2次,正常对照组给予等量蒸馏水。于末次给药后1h(灌药前禁食不禁水12h),颈动脉取血,以1000r/min离心15min,分离血清,然后56℃30min灭活以除去补体,再用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌,密封后置于-20℃冰箱保存备用。2.2分离细胞、培养细胞用传代人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)作细胞培养,按照常规方法复苏,将收获细胞用培养液悬浮后,种植于培养瓶内,置37℃5%CO2培养箱内培养2天,待细胞生长至80%融合时,用于实验。2.3清营汤药物血清的活性将对数生长期的ECV304以105/cm2的密度接种于96孔板,分为5组,待细胞长至融合后,除正常组外,其余各组在造模前均用不含血清的培养液以增强细胞对H2O2损伤的敏感性。即:(1)正常组,含10%小牛血清的培养液;(2)模型组:加H2O2(终浓度为380μmol/L)、不含血清的培养液;(3)血清对照组:加H2O2(终浓度为380μmol/L)、含10%正常大鼠血清的培养液;(4)丹参组:加H2O2(终浓度为380μmol/L)、含10%丹参注射液(终浓度为0.5g/L)的培养液;(5)加减清营汤组:加H2O2(终浓度为380μmol/L)、含10%加减清营汤药物血清的培养液。操作完成后,置于37℃,5%CO2饱和湿度的培养箱中分别培养24h。2.4细胞培养和多次吹打收获对数生长期的细胞,用50～100μL三去污裂解液(含1%NP-40、50mmol/LTris-HCL、150mmol/LNaCl、0.1mmol/LPMSF和1mg/Laprotinin)重悬细胞并反复吹打3～5min;混匀后于4℃温育20min,12000r/min离心20min,取上清作为细胞总蛋白,分装后置于-20℃备用。2.5不连续聚丙烯酰胺凝胶法将细胞总蛋白通过BCA法定量,以确定每个样品的上样体积。取50μg的蛋白质样品与等体积的2×SDS上样缓冲液(100mmol/LtTris-HCL、200mmol/L二硫苏糖醇、4%SDS、0.2%溴酚蓝、20%甘油)混合,于沸水中变性5min,加载于7%或12%Laemmli不连续聚丙烯酰胺凝胶样品孔中;以60V(浓缩胶)/120V(分离胶)电泳至溴酚蓝抵达凝胶前沿;考马斯亮蓝R-250染色,脱色液脱色后观察蛋白条带,以确定最佳电泳条件。2.6凝胶转移转移确定最佳电泳条件后,于该条件下跑电泳,取出凝胶用半干式电转移槽转移2h。5%脱脂奶粉4℃封闭过夜,一抗4℃孵育6h,二抗室温孵育2h,ECL显色观察结果。3血清病理组对vegf表达的影响正常组VEGF由于表达量很低,养化应激状态下VEGF表达有所增加,加减清营汤血清药理组则显著提高H2O2损伤后ECV304中VEGF的表达(见图1)。4抗血栓能力的检测TAO是一种病因尚未完全清楚的疾病,临床上以累及血管的炎症和闭塞性疾病为主。其主要的病理改变为血管腔内的血栓形成、血管壁及周围的广泛纤维化等。以温病清营通脉法代表方剂加减清营汤临床治疗结果表明,清营通脉法能够明显改善血栓闭塞性脉管炎患者的临床症状和体征,改善血液流变学状态,降低全血黏度和血浆黏度,对机体的免疫能力具有一定的调节作用。因TAO患者抗血栓功能的明显紊乱和内皮细胞的自由基损伤有很大关系,本文着力研究加减清营汤对血管内皮细胞的氧化损伤修复作用,从而从另外的角度来揭示其抗血栓的能力。VEGF作为内皮细胞特异有丝分裂原刺激内皮细胞增生、促使血管渗漏、刺激细胞迁移。VEGF还可通过诱导Bcl-2的表达、激活MAPK和抑制c-JNK而抗肿瘤细胞凋亡。据文献报道,VEGF至少有4种剪接变异体,分别由206、189、165和121个氨基酸残基组成,其中VEGF206和VEGF189以与细胞表达蛋白多糖结合的形式存在;VEGF165和VEGF121以可溶性方式分泌。本实验得到的VEGF的Western印迹图谱和文献报道的图谱一致,即分子量在42kDa左右,上面一条带为VEGF165,下面一条带为其变异体。正常组ECV304细胞长至融合后,分裂增