立体定向手术大鼠颞叶癫痫模型的建立及模型永久癫痫病理学基础的观察

立体定向手术大鼠颞叶癫痫模型的建立及模型永久癫痫病理学基础的观察

过去，海洋酸（ka）用于建立大鼠癫痫模型，主要通过系统给药方法进行。国内外偶有局部给药制作颞叶癫痫模型用于科研者,但均未对模型本身进行全面和系统的研究。同时,所用海人酸的浓度和剂量等差异较大。我们通过立体定向技术,对海马局部给药建立大鼠颞叶癫痫模型所需海人酸的浓度和剂量以及模型癫痫敏感性永久存在的病理学基础等进行了较系统和全面的研究,报道如下。材料和方法一、海人酸饲养体重250g的健康成年雄性Wistar大鼠30只,由中国医学科学院动物所提供。采取自由进食水、自然昼夜的方法饲养。海人酸为美国Sigma公司提供。立体定向仪为国营西北光学仪器厂生产。WZ-50型微量注射机由浙江医科大学医学实验仪器厂生产。ML118型脑电图仪为澳大利亚AD仪器公司生产。1720DIGITAL型LEITZ冰冻病理切片机由德国生产。二、方法1.海马ca3的给药点控制系统用10%水合氯醛1ml腹腔内注射麻醉后,将大鼠固定于立体定向仪上。剪除大鼠头顶部的毛发并用75%的酒精消毒处理。沿大鼠头顶部正中线切开头皮,用头皮拉钩将左右两侧的头皮对称地向两侧拉开并固定。确定海马CA3的三维坐标:X=-5.3mm,Y=4.0mm,Z=-6.0mm,即海马区给药点。首先调整X轴和Y轴的坐标,使定位针的尖端位于三维坐标系的H点,H点的坐标为:X=-5.3mm,Y=4.0mm,Z=0mm。然后将位于颅骨上的H点钻透。第二步,在微量注射器内抽入浓度为0.4μg/μl的海人酸2.5μl。然后调整Z轴的坐标,使Z轴的坐标为-6.0mm,即向下进针达CA3中心点。第三步,调整微量注射机的注射速度,使2.5μl海人酸在10min内缓慢匀速地注射完毕,留置3min后退出注射针。然后,全层缝合头皮。对手术后大鼠的行为学进行观察并摄像记录。2.致癫侧海马结构的测定于癫痫发作后6h随机抓取2只癫痫鼠,首先用10%水合氯醛麻醉,然后将其固定在立体定向仪上,注射海人酸侧半侧开颅,利用3个导联记录脑电活动。其中1条电极刺入对侧乳突部头皮下,另1条电极刺入致癫侧的海马结构,第3条电极分别置于嗅球、纹状体和大脑皮质,进行脑电的监测和记录。脑电图记录完毕后,打开胸腔暴露出心脏。用1%和4%的多聚甲醛依次通过心脏进行灌注后,断头完整取出脑组织,放入4%的多聚甲醛中进行固定,然后将脑组织移入30%蔗糖磷酸缓冲液中4℃过夜。在冰冻切片机上切取30μm厚的冠状脑片,进行Nissl染色形态学检查。然后,在模型建立后1d、3d、5d、7d及2周、3周、4周、5周、6周、7周和8周分别随机抓取2只癫痫鼠,进行脑电图监测和病理学检查。结果一、麻醉不同时间后大鼠的癫痫发展情况自海马内注入海人酸后到麻醉清醒的大约1h期间,大鼠基本上处于安静的麻醉状态,偶尔出现身体的瞬间抖动。麻醉清醒后的大约30min内,大鼠的活动较少,有时有凝视和“湿狗样抖动(wet-dogshakes)”。麻醉清醒30min后,大鼠的“湿狗样抖动”和凝视逐渐频繁,间或出现口的咀嚼运动。麻醉清醒近1h时,大鼠逐渐变得略微活跃,口的咀嚼运动和面部抽搐逐渐频繁,并且有大量唾液从口腔流出,同时,大鼠的双眼裂变大,双眼球向外突出,逐渐出现幅度不断增大的点头运动,间或出现左侧(注射对侧)前肢的抽搐和搔头动作。麻醉清醒大约1.5h后,大鼠的前肢抽搐逐渐频繁,前肢的抽搐由单侧(注射对侧)抽搐很快发展到双侧抽搐,抽搐时,前肢向上抬起,身体亦抬起呈半立位,但以注射对侧相对较重。麻醉清醒近2h时,大鼠在不断重复上述表现的基础上,由前肢剧烈抽搐,发展到身体逐渐强直,呈角弓反张,逐渐出现频繁的双后肢抽搐、后退、向后跌倒和身体旋转跌倒,在较短的发作间期,大鼠表现呆板、呆滞。麻醉清醒后3h时,大鼠的发作频率逐渐下降,发作形式主要为身体强直、双后肢抽搐、跌倒、双前肢抽搐、点头、咀嚼、流涎、面部抽搐等。麻醉清醒后5h,发作频率逐渐减少,主要发作形式为双前肢抽搐、咀嚼、点头、流涎等,发作间期逐渐延长,但发作间期的行为仍然呆板、呆滞。麻醉清醒7h时,约10min出现1次发作,主要表现为双侧或单侧前肢抽搐、点头、咀嚼等,发作间期,大鼠变得略微活跃。麻醉清醒8h时,约20～30min有1次发作,表现为单侧前肢抽搐、点头等,发作间歇期,大鼠的活动有所增多,双眼球向外突出逐渐减轻。至麻醉清醒后约11h,大鼠的癫痫发作逐渐停止,大鼠的活动虽有增多,但仍未达到正常大鼠的状态。24h后,大鼠的活动恢复正常。24h至2个月期间,每1周大鼠出现1～3次发作,主要表现为咀嚼、点头、单侧或双侧前肢抽搐、身体强直等。二、海马外胶质与海马的胶波放电模型建立后6h,脑电记录的情况为海马的丛集性棘波放电,嗅球、纹状体和大脑皮质未记录到棘波放电。模型建立后1d,除了海马存在棘波放电外,纹状体和大脑皮质可记录到稀少的与海马棘波同步的棘波放电。模型建立后3d,除了海马密集的癫痫波外,纹状体和大脑皮质的棘波逐渐增多,同时,在嗅球可记录到癫痫波,这些海马外记录到的癫痫波与海马的棘波具有同步性。模型建立后5d至2个月,在癫痫大鼠的海马、纹状体、大脑皮质和嗅球均可记录到较多的癫痫波,但是这些记录到的癫痫波并不完全同步,模型建立的时间越长,上述区域记录到的棘波放电的同步性就越差。三、ca3组织区域的病理变化在海人酸注射后6h、1d、3d、5d、7d时,海马CA3区域密集的锥体细胞出现逐渐加重的肿胀、变性和崩解。1周后,CA3区域的锥体细胞逐渐减少,注射后4周,在CA3部位的神经细胞几乎完全缺失,同时,有大量的胶质细胞增生聚集成胶质团块(图1)。注射对侧的相应区域亦出现类似的病理变化,但出现相对晚些,同时,亦不如注射侧严重。海马齿状回的神经细胞亦逐渐减少。模型的发作形式由海人酸制作癫痫模型可分为系统给药和局部给药两种方法,系统给药操作方便,制作简单,被广为利用。但系统给药制作癫痫模型的不足也逐渐显现出来。首先,系统注射海人酸,药物通过体循环后,进入大鼠脑组织内,因此,不同种属、不同个体和不同年龄的大鼠对海人酸的反应亦表现出明显的不同。相同条件的SD大鼠对海人酸的反应就比同样条件的Wistar大鼠对海人酸的反应迟钝得多,老年大鼠就比年轻大鼠对相同剂量的海人酸要敏感得多。这样就使实验条件的处理和实验研究的设计变得复杂。其次,由于系统给药时,只有不足1%的药物可以透过血脑屏障进入大鼠的脑组织中,与脑内的相应受体结合,海人酸价格昂贵,不难看出其中的浪费。而利用立体定向技术,海马局部按4μg/kg体重注射海人酸,建立大鼠颞叶癫痫模型,虽然操作看似复杂,却避免了系统给药的不足。1972年,Racine提出了记录癫痫大鼠发作时行为学改变的分级标准:I级,咀嚼、眨眼、立须等面部肌肉的抽搐;Ⅱ级,以点头运动为主的颈部肌肉的抽搐;Ⅲ级,单侧前肢的阵挛、抽搐;Ⅳ级,双侧前肢阵挛、抽搐伴身体立起;V级,双侧后肢强直、身体背曲强直、跌倒。在本实验中,大鼠经历癫痫前的频繁的“湿狗样抖动”之后,即进入I级发作状态,很快进入Ⅱ级发作状态,同时,I级和Ⅱ级发作状态会有交叉,之后进入Ⅲ级发作状态,很快即进入Ⅳ级发作状态,Ⅲ级和Ⅳ级发作状态也有交叉,然后,大鼠的癫痫发作进入V级状态。整个的点燃过程经历了从I级到V级的发作,点燃成功后,癫痫大鼠每周出现1～3次I级到Ⅳ级的不同形式的发作,具有了癫痫的长期敏感性。实际上,从发作形式上看,模型模拟了人类颞叶癫痫从“口唇的自动症、涎分泌等植物神经症状、头部的自动症”到“单侧上肢的抽搐、双侧上肢的抽搐”,最后扩展到“下肢阵挛、身体强直阵挛”的全部发作过程,模型的发作形式与人类颞叶癫痫的发作形式极为一致。本模型中,海马CA3区的锥体细胞和海马齿状回的神经细胞在海人酸注射后,伴随着癫痫发作,逐渐缺失减少,最后CA3区域的神经元几乎全部缺失。海人酸是从日本的一种天然海藻中提取的兴奋性氨基酸-谷氨酸的结构类似物,注射后,与海马齿状回中颗粒细胞的轴突末梢上的海人酸受体结合,增加突触末梢膜的通透性,使颗粒细胞中的兴奋性神经递质-谷氨酸大量释放、重吸收减少,引起突触后神经元-海马CA3区域的锥体细胞的过度兴奋毒性,连同谷氨酸本身对CA3区域的锥体细胞的兴奋毒性作用,使CA3区域的锥体细胞逐渐减少甚至完全缺失。海马齿状回中有大量的中间神经元,包括γ-氨基丁酸能神经元,这些中间神经元联系广泛,代谢活跃,因此对氧的变化非常敏感。每一次癫痫发作均会使脑组织出现乏氧的情况,使海马齿状回中的中间神经元因缺氧而出现水肿、变性甚至死亡,因此,在模型的病理改变中,可以观察到齿状回神经元的逐渐减少缺失。在模型的病理变化中,尚可观察到神经元缺失的区域出现胶质细胞增生,形成胶质团块。这样的病理改变同人类颞叶癫痫的病理变化——海马硬化极其一致。成功的癫痫模型,其发作形式和脑电活动必须与人类一致,至少要有脑电的癫痫改变。本模型中,癫痫的棘波放电起源于一侧海马,然后迅速在边缘系统中传播扩布,并可扩布到全脑的皮质,引起相应的一次颞叶癫痫发作。其癫痫之异常电活动的形式与人类颞叶癫痫也是一致的。海人酸引发的颞叶癫痫发作具有长期的癫痫敏感性。首先,海人酸本身的神经兴奋毒性和其引起的传导性神经兴奋毒性使海马内的兴奋-抑制平衡遭到破坏,引发癫痫发作,造成海马神经元的减少、缺失以及随后的胶质细胞增生。其次,在海马神经元的减少中,齿状回中以γ-氨基丁酸能神经元为主的抑制性中间神经元的减少又使海马内的兴奋-抑制平衡进一步破坏,这样,海马神经元的减少和缺失便从癫痫发作的结果变成了再次癫痫发作的原因,如此以来,兴奋-抑制平衡的破坏和海马神经元的减少