海马注射对c57bl6颞叶癫痫小鼠模型的影响

海马注射对c57bl6颞叶癫痫小鼠模型的影响

癫痫（epiepsy）是一种由大脑晶体突然出现异常的同步辐射，导致大脑短暂功能障碍的慢性中枢神经系统障碍综合征。颞叶癫痫(temporallobeepilepsy,TLE)是最常见的局灶性癫痫综合征,异常的癫痫放电起源于大脑颞叶,其中,内侧颞叶癫痫(medialtemporallobeepilepsy,MTLE)是主要发病类型,约占全部颞叶癫痫患者的70%。在内侧颞叶癫痫临床表现中,脑电图显示异常放电多来源于大脑颞叶海马内侧,且具有局灶性;尸检和手术标本的病理学结果显示,患者具有明显异常的海马形态,并且常发生一些特异性的病理改变,包括选择性神经元丢失或神经元退行性病变,星形胶质细胞增生;另外,磁共振(magneticresonanceimaging,MRI)结果表明发生癫痫持续状态的患者大脑海马形态异常。在内侧颞叶癫痫中,有一半患者即使通过多种抗癫痫药物进行联合治疗,仍不能有效地控制发作,在临床治疗上比较棘手,通常需要通过外科手术切除致痫灶,才有可能取得较为理想的治疗效果。并且,这类患者常伴有学习、记忆和认知功能的障碍。于是,推测海马很可能是参与内侧颞叶癫痫发病的关键部位,海马硬化可能在内侧颞叶癫痫发病机制中起重要作用。当前研究内侧颞叶癫痫发病机制的常用方法是建立动物模型,模拟内侧颞叶癫痫的临床表现。本研究中通过建立内侧颞叶癫痫C57BL/6小鼠模型,检测其在行为学、病理学上的表现,初步探讨内侧颞叶癫痫的发病机制。1材料和方法1.1实验动物及仪器实验动物为SPF级,健康成年雄性C57BL/6小鼠(北京维通利华有限公司),8～10周龄(合格证号:0190894)。实验前将动物置于通风处饲养,24h明暗各半,自由进食和饮水,生活状态正常的小鼠入选实验。单臂脑立体定位仪、微型手持式颅钻(深圳瑞沃德生命科技有限公司);0.5μL微量进样器Microlitersyringes(上海高鸽工贸有限公司);采用10%水合氯醛作为麻醉剂;海人酸(Sigma公司)使用浓度为4mg/mL;采用4%的甲醛固定脑组织;兔抗鼠GAPDH多克隆抗体、兔抗鼠P-S6多克隆抗体(CST公司);辣根过氧化物酶HRP、ECL化学发光试剂盒(Promega公司)。1.2海人酸对海马的定位注射将小鼠分为空白对照组(3只)、0.9%氯化钠注射组(10只左右)和海人酸(40只左右)注射组。将注射组小鼠(生理盐水组和海人酸组小鼠)置于立体定位仪上,根据预实验摸索并优化麻醉剂用量、海人酸注射量和注射部位的各参数,得到以大脑Bregma为原点的海马定位注射坐标:-2.0、-1.8、-2.3mm(右侧海马),进行单侧注射海人酸12mg/kg后,观察其行为表现。生理盐水组以35μL/g生理盐水取代海人酸,其余步骤和注射方式同海人酸组。1.3肌肉物理分级iii、v级海人酸注射小鼠发生的痫性发作按Racine分级标准进行判定:I级,咀嚼、眨眼、立须等面部肌肉抽搐;II级,以点头运动为主的颈部肌肉抽搐;III级,单侧前肢阵挛、抽搐;IV级,双侧前肢阵挛、抽搐伴身体立起;V级,双侧后肢强直,身体背曲强直,跌倒伴全身阵挛。以在急性期出现持续1h以上的III级以上发作,经过4～5周的静止期后,在慢性期出现自发发作且状态良好的小鼠为内侧颞叶癫痫成功模型鼠。1.4免脑电泳和海马法分别取海人酸注射后5d和5周作为内侧颞叶癫痫急性期和慢性期模型,开颅取脑后固定,并逐级脱水、透明、浸蜡和石蜡包埋,切片后进行苏木精和伊红染色,光镜下观察海马病理改变。1.5蛋白质浓度测定本实验采用高浓度的SDS提取海马组织蛋白,以保持蛋白质在提取过程中的完整性。分别取海人酸注射后3h和5d的模型鼠大脑的海马组织置于研钵中,倒入液氮使其瞬间冷却,待液氮挥发后,研钵海马至粉末状,待组织初步研碎后,加入250μLSDS裂解液,并倒入液氮,直至组织充分研碎至细沙状,将其转入1.5mL离心管中,室温放置10min,待融化成液体,沸水浴5min后,冷却至室温,13000r/min常温离心10min,取上清至新的1.5mL离心管中,利用BSA试剂盒测蛋白质浓度。根据蛋白质浓度结果,计算蛋白质上样量,按每个上样孔150μg蛋白质等量上样,用Westernblot检测海马组织中P-S6蛋白质表达量的改变。2结果2.1小鼠癫痫状的反应与空白对照组相比,0.9%氯化钠注射组小鼠在单侧海马注射0.9%氯化钠后生命活动正常,未发生明显的行为学异常。在海人酸注射组中,小鼠死亡率低于15%。海人酸注射组小鼠的行为表现出明显的3个阶段:急性期、静止期及慢性期。急性期:注射海人酸几分钟后,小鼠立即出现动须、面部肌肉抽动和排便。麻醉消退后,出现RacineⅠ、Ⅱ级痫性发作,持续约5min后,开始出现III级前肢发作,之后逐渐发展为IV双侧前肢发作,持续约30～40min。在这个过程中,小鼠表现出以持续性的Ⅲ、Ⅳ级发作行为为特征的癫痫持续状态。之后,小鼠发作程度逐渐减缓,2～3h后逐渐停止抽搐,癫痫持续状态缓解,进入潜伏期。静止期:小鼠癫痫症状基本消失,表现为精神萎靡,活动少,反应迟钝。隔夜之后,小鼠活动恢复正常,进食、行动与正常小鼠无异。慢性期:海人酸注射3周后,小鼠开始出现自发痫性发作,以Ⅱ级发作开始,短时间内发展为Ⅲ、Ⅳ级全身性强直抽搐,持续约1min后自行缓解,且发作具有反复性。2.2海人酸对侧与注射侧锥体神经元丢失程度的比较急性期:注射海人酸后,取急性期模型小鼠进行脑切片染色观察发现注射侧CA3区病变出现得最早且较明显,锥体神经元发生明显丢失,随着急性期的发展,CA3区锥体神经元丢失程度加深。此外,海人酸对侧与注射侧相比,未观察到明显的病理改变,与对照组无异(图1)。静止期:海马注射侧CA3区锥体神经元丢失程度加深,CA1区锥体神经元缺失逐渐明显,较急性期有明显增多,受累程度逐渐加深。慢性期:齿状回区域扩大,颗粒细胞明显分散并部分占据CA3和CA1区,观察到明显的齿状回颗粒细胞散布现象。同时,CA3区锥体神经元已基本上完全丢失,CA3细胞层基本消失,区域界限也已经模糊,CA1区锥体神经元基本丢失(图2)。2.3海马中p-s1蛋白质表达水平的测定Westernblot检测发现小鼠在海人酸分别注射3h和5d后,海马中P-S6蛋白质表达水平较空白组均上调,并利用ImageJ软件计算电泳条带灰度值(图3)。3模型病理改变的促进C57BL/6小鼠癫痫模型与内侧颞叶癫痫临床表现具有相似性。在癫痫发作过程中,出现以部分或全身抽搐为表现形式的继发性全身大发作时,可在动物模型中显著的表现出来。本实验观察到C57BL/6小鼠在急性期的全身抽搐发作和慢性期的自发发作均与内存颞叶癫痫的临床发病特点一致,也就是说本实验通过单侧海马注射海人酸的方式建立的小鼠模型能在行为学上较好的模拟内侧颞叶癫痫发病。然而,动物模型的行为表现只是检测模型的一方面指标,另一方面更重要的是动物模型海马的病理改变。众多研究表明海马硬化是内侧颞叶癫痫患者特征性的病理改变,表现为神经元丢失、颗粒细胞散布和神经元可塑性改变,从而产生异常的神经元结构和神经兴奋传导通路,使海马神经元兴奋性持续处于较高水平,易引发大脑同步异常放电,从而导致癫痫发生。但是癫痫发生过程较复杂,海马硬化与内侧颞叶癫痫发病的具体因果关系及其参与的机制尚不完全明确。mTOR通路与内侧颞叶癫痫发病具有相关性。内侧颞叶癫痫形成过程中,大脑发生一系列细胞分子水平的改变,研究者推测,在如此复杂多层次的生命活动过程中,必然有多种信号通路参与其中。近年来,mTOR通路与内侧颞叶癫痫发病的相关性受到越来越多的关注。早期研究发现,mTOR通路与结节性硬化症(Tuberoussclerosiscomplex,TSC)中的癫痫发作、胶质细胞增生和神经元异常凋亡等类似于内侧颞叶癫痫的行为学和病理学的表现有关。本研究检测到mTOR通路活性在癫痫急性期和慢性期中皆被激活,首次报道了用单侧海马注射海人酸的方式建立的C57BL/6小鼠癫痫模型中,mTOR通路活性改变可能与内侧颞叶癫